耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌在EICU的臨床分布及耐藥性

張可,許秋然

(浙江省人民醫院 急診科，浙江 杭州 310014)

耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌在EICU的臨床分布及耐藥性

張可Δ,許秋然

(浙江省人民醫院 急診科，浙江 杭州 310014)

目的 探討耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌在急診重癥監護病房(EICU)的臨床分布及其耐藥性的影響。方法 選取在2011年1月～2015年12月期間，浙江省人民醫院定植或感染了耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌的重癥患者為觀察對象，對分離得到的耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌進行了分型、耐藥性研究以及其奈唑胺耐藥性的形成機理研究；并進一步研究耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌發病率與利奈唑胺使用量之間的關系。結果 在研究期間，共計有49例患者根據臨床標本分離出耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌株系，其中表皮葡萄球菌有40株(81.6%)，人葡萄球菌有9株(18.4%)；藥敏試驗表明耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對青霉素、左氟氧沙星、氨芐西林的耐藥性達到了90%以上，對四環素、阿莫西林、紅霉素的耐藥性在60%以上；耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌在G2576T、L4、L5和L22區域出現突變的概率分別是87.5%、80%、50%和0；利奈唑胺使用量和耐利奈唑胺菌株發病率之間存在顯著的相關性(R=0.293，P<0.05)。結論 耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對多種常見抗生素具有耐藥性，說明該類細菌的耐藥性問題已相當嚴峻；同時利奈唑胺耐藥性形成機理并不單一，細菌在G2576T、L4、L5和L22區域出現基因突變均可能形成利奈唑胺耐藥性；利奈唑胺使用量和耐利奈唑胺菌株發病率之間存在顯著的相關性。

利奈唑胺耐藥性；凝固酶陰性葡萄球菌；急診重癥監護病房

為了探討耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌在急診重癥監護病房(EICU)的臨床分布及對其耐藥性進行研究，本文對2011年1月～2015年12月期間從浙江省人民醫院定植或感染了耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌的49例重癥患者分離得到的耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌進行了分型、耐藥性研究以及其奈唑胺耐藥性的形成機理研究；并進一步研究耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌發病率與利奈唑胺使用量之間的關系。現將研究成果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取在2011年1月～2015年12月期間于浙江省人民醫院定植或感染了耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌的49例重癥患者(血液分布42例，尿分布6例，腹水1例)作為研究對象。其中男40例(81.6%)，女9例(18.4%)，年齡39～82歲，平均年齡(60.8±14.7)歲，住院時間19～63 d，平均(45.0±10.2)d；患者主要來源于急診科(21例，42.9%)和內科(12例，24.5%)；入住急診重癥監護病房(EICU)的原因有呼吸衰竭(20例，40.8%)、休克(9例，18.3%)、多發傷(7例，14.3%)、中風(5例，10.2%)和其它(8例，16.3%)；在進行抗利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌分離研究的前1個月內，大部分患者都進行了一種或多種抗生素治療，主要有利奈唑胺(43例，87.8%)，β-內酰胺類抗生素(42例，85.7%)、碳青霉烯類抗生素(27例，55.1%)。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法：按照傳統微生物菌種分離和鑒定技術分離和鑒定所得的49種耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌菌株。根據《全國臨床檢驗操作規程》進行藥敏試驗測定[6]，分別評估了耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對青霉素、左氟氧沙星、氨芐西林、紅霉素等10種常用抗生素的耐藥性。此外，還通過cfr基因的PCR試驗擴增了耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌rRNA 23S位點的V區域以及在核糖核蛋白L3、L4和L22區域的突變序列，并使用了DNASTAR軟件進行了擴增序列的排序和分析。

1.2.2 評價標準：依據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)中的NCCLS標準判定藥敏檢測結果。根據美國胸科醫師學會(ACCP)對于患者感染的嚴重程度進行評級：膿毒癥、嚴重膿毒癥和膿毒癥休克。同時，對微生物學反應定義如下：根治型(在治療末期培養結果為陰性)、持續型(在治療期間培養結果為陽性)。

1.3 統計學方法 采用絕對頻率和百分比進行定性變量描述，采用Kolmogorov-Smirnov(K-S)檢驗正態分布情況。組別之間的差異性檢驗采用Student’s t(T)法連續變量。當結果數據稀少的情況采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌分類鑒定結果 經過分離培養49株耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌分類鑒定結果顯示：表皮葡萄球菌40株(81.6%)，人葡萄球菌9株(18.4%)。

2.2 耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌藥敏試驗結果 通過對49株耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌進行藥敏試驗測試，發現在常用的10種抗生素中，耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對青霉素、左氟氧沙星、氨芐西林的耐藥性達到了90%以上；對四環素、阿莫西林、紅霉素的耐藥性在60%以上；對萬古霉素、利福平的耐藥性在30%以上，對頭孢呋辛、克林霉素的耐藥性較低，見表1。由表1可知，目前耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對多種常用抗生素具有普遍的耐藥性，該類細菌的耐藥性問題已經相當嚴峻。

表1 耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對常用抗生素的耐藥性研究Tab.1 The drug resistance of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci to common antibiotics

2.3 耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌耐藥性形成機理研究 在耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌分離菌株中，共計有35.2%(6/17)的cfr基因表達為陽性。對2014年得到的8種耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌分離菌株進行了分子生物學研究，見表2。通過對rRNA 23S位點V區域上的基因進行排序和分析，發現共有7株菌株(87.5%)中存在G2576T突變，4株菌株(50%)在核糖核蛋白L3位置發生突變。同時，4株菌株(50%)在核糖核蛋白L4位置發生突變。沒有菌株在核糖核蛋白L22位置發生突變，其中WT為野生型。

表2 耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌耐藥性形成機理研究

從40株耐利奈唑胺表皮葡萄球菌菌株中選取7株進行脈沖場凝膠電泳(PFGE)的圖形分析，見圖1。從圖1中可知，第1、2、3、4、6、7號菌株相互間具有同源性，第5號菌株與其余6株菌株不具有同源性。這表明大多數的耐利奈唑胺表皮葡萄球菌菌株之間具有遺傳學相關性。

圖1 耐利奈唑胺表皮葡萄球菌菌株PFGE分析結果Fig.1 The PFGE result of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci

2.4 利奈唑胺使用量與耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌發病率之間的關系研究 在研究期間，耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌患病數和利奈唑胺的使用量均逐漸下降，見圖2、圖3。從圖2、圖3可知：在2011年分離出11例，2012年17例，2013年14例，2014年3例，2015年4例，總共分離出49例耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌。在研究期間，利奈唑胺臨床用率平均為12.2 DDDs/100住院天數。各年利奈唑胺臨床用率(DDDs/100住院天數)分別為14.4(2010年)、13.8(2011年)、14.0(2012年)、11.6(2013年)、11.4(2014年)和8.1(2015年)。數據統計分析結果表明：在研究期間，利奈唑胺的使用量有顯著下降(R=-0.378，P<0.05)。利奈唑胺使用量和耐利奈唑胺菌株發病率之間存在顯著的相關性(R=0.293，P<0.05)。

圖2 研究期間每年耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌患病數Fig.2 The prevalent cases of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci in each year during research period

圖3 研究期間每年利奈唑胺使用情況Fig.3 The usage of linezolid in each year during research period

3 討論

利奈唑胺是一種人工合成的唑烷酮類抗生素，在臨床上普遍應用于治療革蘭陽性(G+)球菌引起的各種感染。盡管迄今為止，葡萄球菌對利奈唑胺的耐藥比例依然很低。但國內外最新研究成果[7～8]表明：近年來，耐利奈唑胺的凝固酶陰性葡萄球菌發病率在不斷攀升。因此，有必要對耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對常用抗生素的耐藥性展開研究。同時，雖然目前利奈唑胺的抗菌作用機制已經明確：利奈唑胺是一種細菌蛋白質合成抑制劑，通過與細菌核糖體RNA的23S位點相結合，阻止70S起始復合物的合成，從而抑制細菌蛋白質的合成[9]，但關于凝固酶陰性葡萄球菌耐利奈唑胺抗藥性形成機理研究還十分不足。夏夢巖等[10]認為凝固酶陰性葡萄球菌具有耐利奈唑胺抗藥性的主要原因是在rRNA的23S位點V區域發生了基因改變(主要為G2576T突變)，其次也可能為核糖核蛋白L3/L4位置發生基因突變。而Gu等[11]認為利奈唑胺耐藥性形成機理也可能在于可轉移的質粒載體核糖體甲基轉移酶基因(cfr gene)。此外，利奈唑胺使用量與耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌發病率之間存在聯系。Sanchez García等[12]認為利奈唑胺在臨床應用中的增長在一定程度上導致了耐利奈唑胺的凝固酶陰性葡萄球菌的出現。

本文通過選取本院2011年1月～2015年12月定植或感染耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌的49例重癥患者為觀察對象，對分離得到的耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌進行了分型、耐藥性研究以及其奈唑胺耐藥性的形成機理研究；并進一步研究耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌發病率與利奈唑胺使用量之間的關系。結果顯示，具有耐利奈唑胺的凝固酶陰性葡萄球菌主要由表皮葡萄球菌和人葡萄球菌突變形成；耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌對多種常用抗生素具有普遍的耐藥性，說明該類細菌的耐藥性問題已經相當嚴峻；耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌在G2576T、L4、L5和L22區域出現突變的概率分別是87.5%、80%、50%和0，這說明利奈唑胺耐藥性形成機理并不單一；研究還發現，利奈唑胺使用量和耐利奈唑胺菌株發病率之間存在顯著的相關性，利奈唑胺的使用量與耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌的發病率大體上呈正相關。

綜上所述，目前研究表明耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌已經出現在急診重癥監護病房(EICU)中的危重患者當中。研究表明，利奈唑胺臨床用量較低時能有有效降低耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌的發病率。因此，臨床上應更加重視利奈唑胺的合理使用，盡量減少細菌對該類藥物產生耐藥性。

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(編校：王儼儼)

Clinical distribution and drug resistance of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci in EICU

ZHANG KeΔ, XU Qiu-ran

(Department of Emergency, Zhejiang People Hospital, Hangzhou 310014, China)

ObjectiveTo explore the clinical distribution and drug resistance of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci (CoNS) in intensive care unit (EICU).MethodsAn observational study was conducted in critically ill patients colonized or infected by linezolid-resistant CoNS in our hospital between from January 2011 to December 2015.The epidemiological and clinical features, and the mechanism of resistance to linezolid.The association between the incidence of linezolid-resistant CoNS strains and the consumption of linezolid in the study period were evaluated.ResultsDuring the study period, 49 patients had a linezolid-resistant CoNS strain isolated from clinical sample.Forty (81.6%) isolates were identified asS.epidermidisand nine wereS.hominis.The result of susceptibility testing indicated that linezolid-resistan CoNS had more than 90% resistant to penicillin, levofloxacin and ampicillin.Meanwhile, linezolid-resistan CoNS also had more than 60% resistant to tetracycline, amoxicillin and erythromycin.Molecular analysis confirmed the presence of mutation of G2576T, L3, L4 and L22 in 87.5%, 80%, 50%and 0, respectively, of the strains tested.Beside, a modest significant correlation was observed between the decrease in linezolid consumption and the lower incidence of resistant isolates.ConclusionLinezolid-resistant CoNS has resistant to many kinds of antibiotic.Meanwhile, molecular analysis confirms the presence of mutation of G2576T, L3, L4 and L22 of the strains tested, which confirms that different mechanisms of resistance to linezolid could coexist.Beside, a significant correlation is found between linezolid consumption and the incidence of linezolid-resistant CoNS strains.

linezolid-resistant; coagulase-negative staphylococci; emergency intensive care unit

張可，通信作者，本科，主治醫師，研究方向：急診內科，E-mail: 2832212851@qq.com。

R446.5

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.62