秦巴山區黑木耳菌株酯酶同工酶的分析

錢雪婷++陳文強++彭浩++解修超++鄧百萬

摘要：對秦巴山區41個黑木耳供試菌株進行酯酶同工酶垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結果表明，41個供試菌株共檢測到19條不同遷移率酯酶同工酶酶帶，各菌株有5～9條不等的酶帶，共16個酶譜類型。應用NTSYS-pc 2.11軟件分析，41個黑木耳菌株兩兩之間的相似系數分布在0.474～1.000之間，當遺傳相似系數為80%時，41個黑木耳供試菌株被聚類分成5類，初步鑒定了41個供試菌株間的親緣關系。

關鍵詞：秦巴山區；黑木耳；酯酶同工酶；親緣關系

中圖分類號： S646.603文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0269-03

收稿日期：2015-09-23

基金項目：陜西省科學技術研究發展計劃（編號：2014K01-16-03）；陜西省科技統籌創新工程計劃（編號：2012HBGC-20）。

作者簡介：錢雪婷（1990—），女，陜西略陽人，碩士研究生，主要從事微生物資源利用開發等研究。E-mail：qianxueting163@163.com.

通信作者：陳文強，教授，碩士生導師，主要從事微生物資源開發保護及利用相關研究。E-mail：wenqiangc@126.com.黑木耳（Auricularia auricular），別稱木耳、細耳、云耳、黑葉、木蛾，分類上屬異擔子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬，子實體一般較小，膠質，淺圓盤形、耳形或不規則形[1]，是一種含有極高營養價值和藥用價值的美味食用菌[2]。現代研究表明，黑木耳具有抗氧化、抗菌、抗癌，增強體液免疫等多種功效[3-5]。秦巴山區氣候溫和濕潤，適宜菌類生長，是我國黑木耳的主要栽培基地之一。近年來，由于部分地區對黑木耳菌株的管理存在很多缺陷，黑木耳菌株亂引種、亂命名的現象較為嚴重，使同一菌株冠以不同的品種代號或不同菌株冠以相同的品種代號，造成黑木耳菌種、品種的混亂。目前，黑木耳種質資源遺傳多樣性的研究逐漸受到重視，Tang等[6]、李媛媛等[7]、張旭等[8]、唐利華等[9]分別利用ISSR和SRAP分子標記、SCAR分子標記、SRAP和ITS分子標記、酯酶同工酶分析對我國不同地區黑木耳栽培菌株以及野生菌株的親緣關系，結果表明，我國黑木耳菌株具有較高的遺傳多樣性。本研究利用酯酶同工酶技術對秦巴山區41個黑木耳菌株的親緣關系進行分析，旨在為黑木耳菌種管理和種質資源遺傳多樣性的研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株秦巴山區41個黑木耳供試菌株及來源見表1。

1.1.2培養基母種培養基（CPDA）：20%馬鈴薯，2%葡萄糖，0.5% KH2PO4，0.3% MgSO4·7H2O，0.001% 維生素B1，1.2%瓊脂，pH值自然。同工酶制備液體培養基（元蔥培養基）：20%元蔥，1%蔗糖，0.006%阿魏酸，pH值自然。

1.1.3主要儀器高壓蒸汽滅菌鍋（MJ-54A型，上海施都凱儀器設備有限公司）；超凈工作臺（SW-CJ-2F型，蘇州凈化設備有限公司）；電子分析天平（TB-214型，北京賽得利斯儀器系統有限公司）；離心機（5418R型，德國Eppendorf）；電泳儀（DYCZ-24B型，北京市六一儀器廠）；凝膠成像系統（GEL-RAD型，美國伯樂）。

1.2方法

1.2.1樣品制備將黑木耳菌株接種于CPDA斜面培養基，28 ℃培養，待菌絲長滿管后，4 ℃冰箱保藏備用；將活化后的黑木耳菌株，接種到元蔥培養基中，250 mL三角瓶裝液量為100 mL，28 ℃靜置培養20 d。將菌絲體過濾，蒸餾水沖洗，濾紙吸干水分，稱質量，放入研缽中，加入液氮充分研磨，分裝于離心管，8 000 r/min，4 ℃離心20 min，上清液為酶液。

1.2.2酯酶同工酶的檢測采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法[10]，配制5%濃縮膠，10%分離膠，電極緩沖液為Tris-Glycine系統，pH值8.3。上樣量：酶液6 μL，溴酚藍指示劑2 μL，10%蔗糖5 μL。濃縮膠電壓80 V，室溫，電泳45 min，分離膠電壓120 V，4 ℃，電泳4 h。取下凝膠，置于α、β-乙酸萘酯和堅牢藍配制的染色液中，37 ℃，輕微振蕩，染色 25 min，將出現紅褐色酶帶的凝膠置于7%醋酸溶液中脫色、保存，掃描照相。

1.2.3聚類分析相對遷移率Rf=X/Y，X為從點樣孔下沿開始，酶帶在凝膠中的遷移距離，Y為從點樣孔下沿開始，指示劑在凝膠中的遷移距離。在測量遷移距離時，以酶帶的中部位置為準。依據酯酶酶譜，按照條帶的有無進行標記，在相同遷移率位置上，有條帶的記為1，無條帶的記為0。利用NTSYS-pc 2.11軟件，分析得到秦巴山區41個黑木耳菌株的聚類分析樹狀圖。

2結果與分析

2.1酯酶同工酶酶譜分析

秦巴山區41個黑木耳供試菌株酯酶同工酶酶譜見圖1。根據各菌株間酶帶顏色和寬窄的差異[9]，酯酶酶帶可分為：一級酶帶（色深而寬）；二級酶帶（色較深而寬）；三級酶帶（色較淺而窄）；四級酶帶（色很淺而窄），結合酯酶酶譜，繪制酯酶同工酶模式圖（圖2）。

圖1顯示，秦巴山區41個黑木耳供試菌株共檢測到281條酯酶同工酶酶帶，各菌株有5～9條不等的酶帶，且多數為6～8條。41個供試菌株的遷移率分析表明，共有19條遷移率不同的酶帶，遷移率都在0.344～0.606之間。41個供試菌株在Rf值為0.356和0.469這2處均有酶帶出現，可能為黑木耳的共有酯酶酶帶。41個菌株共得到16個酶譜類型，其中黑木耳36#、耳菊3#、耳266、耳913、耳2、耳269、神農A8、RF201以及甘1各為1個酶譜類型；耳5#、分四、國興2#、野1#、耳1#、國興1#、耳冬梅1#、高產1#、耳3#、新耳5#、新科1#、木耳（袋）、耳256以及新科的酶譜帶型基本相同；耳91、新科4#、LY16#、商洛Li、耳801以及耳261的酶譜帶型基本相同；QD3#、QD4#、新科5#以及Au29的酶譜帶型基本相同；耳238與耳629的酶譜帶型基本相同；耳268與112冬的酶譜帶型基本相同；國興3#與分六的酶譜帶型基本相同；耳235與耳97-2的酶譜帶型基本相同。

圖2顯示，在相同Rf值處，不同黑木耳菌株的酶帶等級不同（酶帶顏色深淺與寬窄不同）。且41個黑木耳菌株在Rf值為0.441處，一級酶帶較多，表明黑木耳菌株該酯酶活性高且含量高；在Rf值為0.469與0.494這2處，二級酶帶較多，表明這些酯酶活性較高且含量較高；在Rf值為0.356、0.396以及0.586等處，三級酶帶與四級酶帶較多，表明這些酯酶活性低且含量低。

2.2聚類分析

根據酯酶酶譜，應用NTSYS-pc 2.11軟件，構建秦巴山區41個黑木耳供試菌株聚類分析樹狀圖（圖3）。

圖3顯示，當遺傳相似系數為70%時，秦巴山區41個黑木耳供試菌株被聚類分成3類。當遺傳相似系數為80%時，41個黑木耳供試菌株被聚類分成5類，第1類：耳266、國興3#以及分六；第2類：耳5#、分四、國興2#、野1#、耳1#、國興1#、耳冬梅1#、高產1#、耳3#、新耳5#、新科1#、木耳（袋）、256、新科、耳菊3#、耳268、112冬、耳91#、新科4#、LY16#、商洛Li、耳801、耳261、36號、耳238、耳629以及耳913；第3類：QD4#、QD3#、新科5#、Au29以及RF201；第4類：耳97-2、耳235、耳269以及神農A8；第5類：耳2以及甘1。

3討論

同工酶分子標記是從基因產物水平來研究生物的遺傳變異，是一種重要的分子遺傳標記技術[11]，酶帶的變化可作為鑒定物種，研究分類、進化、遺傳和變異的重要指標[12]，也是對食藥用菌進行遺傳分析或生化鑒定中的最適標記手段之一。自Markert等提出同工酶概念以來，酯酶同工酶標記技術在食用菌研究中逐步得到廣泛的應用[13-15]。

本研究將秦巴山區41個黑木耳供試菌株在嚴格統一的條件下，如相同的培養溫度、時間，相同的酶液制備方法等，采用5%濃縮膠與10%分離膠進行垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，共檢測到19條不同遷移率的酯酶酶帶，16個酶譜類型，當遺傳相似系數為80%時，聚類分成5類，如耳97-2、耳235、耳269以及神農A8被聚類在一個分支上，表明這4個菌株親緣關系較近。彭浩等對陜南10種黑木耳主要栽培種進行酯酶同工酶的分析，檢測到8條不同遷移率的酯酶酶帶，當遺傳相似系數為80%時，聚類分成5類[16]。與之相比，本研究選用的供試菌種地域和菌株數更為廣泛，且檢測出的酯酶酶帶較豐富，聚類結果更加精細。

通過酯酶同工酶分析，得到秦巴山區41個黑木耳供試菌株聚類分析樹狀圖，初步鑒定了不同菌株之間的親緣關系。結果表明，秦巴山區黑木耳菌株的酯酶多態性高，種質資源較為豐富，為秦巴山區黑木耳優良菌種的選育以及菌種的管理工作提供理論依據。由于酯酶活性很容易受到外界因素的影響，酯酶同工酶的穩定性以及試驗的可重復性不高，對秦巴山區41個黑木耳供試菌株進行RAPD和酯酶同工酶指紋圖譜的分析還有待進一步研究。

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