MSCs在缺氧狀態下的基因差異性表達

徐梁　白珊珊　段惠川　余東

MSCs在缺氧狀態下的基因差異性表達

徐梁白珊珊段惠川余東

【摘要】目的探討MSCs在缺氧環境中細胞生物學特性及相關生長因子的變化，為修復組織損傷提供臨床應用依據。方法體外進行MSCs缺氧處理，免疫熒光染色觀察細胞特性，RT-PCR檢測VEGF、bFGF、TGF-β和IL-1α基因，從細胞分化、生長因子和細胞信號通路等方面，來探討MSCs在缺氧環境下發生的轉變。結果MSCs經1%O2缺氧培養24 h后，鏡下觀察示細胞成活良好，未見形態、生長方式等發生明顯變化。免疫熒光及雙熒光染色觀察缺氧處理24 h的MSCs有向內皮細胞，特別是血管內皮轉化的趨勢。VEGF、bFGF、TGF-β和IL-1α在缺氧處理后的MSCs中表達均增強，而未經缺氧處理的MSCs相關因子表達微弱。結論在缺氧的環境下，MSCs可向血管內皮細胞方向分化，并且與促進血管形成和生長相關的VEGF、bFGF、TGF-β和IL-1α基因表達均增強，可直接或間接促進損傷組織的血管化。

【關鍵詞】間充質干細胞基因表達血管化缺氧培養

間充質干細胞 （Mesenchymal stem cells，MSCs）是具有自我更新與多向分化潛能的成體干細胞，可分化為骨、軟骨、肌肉、脂肪、真皮、神經等多種組織，干細胞移植可廣泛應用于各種組織損傷，包括心肌缺血及缺血再灌注損傷[1]、急性腎衰竭[2]、肺損傷[3]、皮瓣修復[4]等。早期研究發現，組織損傷所造成的缺

1　材料與方法

1.1材料

實驗動物：4周齡的Wistar雄性大鼠，體質量約200 g（中國科學院上海實驗動物中心提供）。

試劑：DMEM-LG培養液（Gibco，美國）；PBS、FBS （HYCLONE，美國）；胰酶、FITC-UEA-1（Sigma，美國）；青霉素，鏈霉素（Gibco，美國）；RT-PCR試劑盒（Takara，日本）；引物合成（上海博邁生物技術公司）；FITC、PE、CD45，CD90（eBioscience，美國）；Ⅷ因子（Abcam，美國）；DiI-ac-LDL（Molecular Probes，美國）。

儀器：低氧培養箱（Binder，德國）；定量PCR擴增儀（Stratagene，美國）；熒光顯微鏡（Nikon，日本）。1.2方法

1.2.1MSCs的分離、培養與傳代

4周齡Wistar雄性大鼠處死后，75%乙醇浸泡30 min；移至超凈臺中，無菌條件下獲取兩側股骨和脛骨，剔除軟組織。用2 mL注射器抽取DMEM-LG培養液，反復沖洗骨髓腔，沖出骨髓，所得懸液以200目鋼網過濾，置于50 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min后棄上清，PBS（含2%FBS）5 mL重懸，充分吹打，將懸液緩慢地疊加到預先裝有5 mL Percoll細胞分離液（密度為1.077 g/mL）的15 mL離心管上層，2 200 r/min離心30 min，小心吸取分離介質之間白色混濁帶，將其移入新的50 mL離心管中，加入PBS，震蕩混合均勻后，離心去上清，如此反復洗滌2遍。以DMEM-LG全培養基（含10%FBS，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）重懸，定容至10 mL，吸取30 μL細胞懸液與臺酚藍染液對比稀釋后，在計數板上計數并檢查細胞活力。

加入DMEM-LG全培養基，以5×106cells/mL密度接種于10 cm培養皿中，在37℃、5%CO2正常氧分壓的飽和濕度培養箱內原代培養，4 d后首次換液，去除非貼壁細胞，以后每2～3天換液1次。

細胞生長達到80%～90%融合時，進行傳代，吸除培養液，PBS洗滌2遍，吸盡后加入約1 mL 0.05%胰酶消化液，鏡下觀察細胞出現收縮后，一般約在10 sec左右，加入含10%FBS的DMEM-LG培養液3 mL終止消化，以頭部裝有細膠管的細胞刮子輕輕地將培養皿底部的細胞刮下，收集在50 mL離心管中，1 500 r/min離心 5 min后棄上清，以DMEM-LG培養基重懸，定容至10 mL，吸取30 μL細胞懸液與臺酚藍染液對比稀釋后，在計數板上計數并檢查細胞活力。加入適量的DMEM-LG培養液，按1∶4的比例接種，進行傳代培養。

在倒置相差顯微鏡下連續觀察MSCs的原代和傳代培養的貼壁時間、生長特點、細胞形態、基質分泌和融合程度。

1.2.2MSCs的鑒定

收獲第3代的MSCs，消化后過濾制成單細胞懸液，將細胞懸液中分別依次加入CD45、CD90。4℃環境下，避光，培育30 min，PBS沖洗后移入冰盒，進行流式細胞儀檢測。

1.2.3細胞缺氧培養

取傳代24 h后的第3代的MSCs，置于37℃、5%CO2、1%O2、飽和濕度的缺氧培養箱內培養24 h。

1.2.4免疫學方法

進行細胞的Ⅷ因子免疫組化，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞的Flk-1免疫熒光。

1.2.5雙熒光染色測定

分別取缺氧處理和正常培養的第3代MSCs消化傳代至24孔板中，24 h后進行Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色。細胞在含10 μg/mL Dilac-LDL的培養液中避光孵育10 h，4%中性甲醛固定10 min，PBS漂洗，加10 μg/mL FITC-UEA-1避光孵育1 h。PBS再次漂洗，熒光顯微鏡觀察，顯示紅色熒光的為ac-LDL陽性細胞，綠色熒光的為UEA-1陽性細胞，雙熒光陽性的細胞則為黃色。最后，為觀察細胞陽性數，將細胞核染成藍色。

1.2.6RT-PCR檢測方法

分別抽提缺氧培養和正常培養的MSCs的總RNA。根據研究需要，確定需檢測的基因為：VEGF、bFGF、TGF-β和IL-1α。在GENEBANK查出其gi號和mRNA全序列。在Primer軟件上設計引物，引物設計完畢后，進行BLAST驗證，得出最佳引物（內參為β-actin，長度為592 bp）。PCR反應后應用Gel-Pro Imager Kit凝膠圖像處理系統在紫外光下觀察VEGF、bFGF、TGF-β、IL-1α的表達（表1）。

2　結果

2.1倒置顯微鏡觀察

MSCs經1%O2的缺氧培養24 h，鏡下觀察細胞成活良好，未見形態、生長方式等的明顯變化（圖1）。

2.2MSCs的流式細胞學鑒定

流式細胞鑒定所培養貼壁細胞為 CD45－、CD90＋，符合MSCs特點，細胞純度80%以上（圖2）。

2.3免疫組化及免疫熒光觀察

缺氧處理24 h的MSCs，其Ⅷ因子及Flk-1表達為陽性，而正常培養的MSCs則未見表達，表明MSCs在缺氧的狀態下有向內皮細胞，特別是血管內皮轉化的趨勢（圖3，4）。

2.4雙熒光染色

Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色發現，缺氧處理的MSCs很多表現為雙熒光染色陽性，在熒光顯微鏡下呈現紅加綠合成的黃色（圖5），而正常培養的第3代MSCs很少出現雙熒光陽性表現。針對ac-LDL的吞噬功能是內皮細胞的特點，雙熒光染色陽性往往作為血管內皮祖細胞的一個特性，結果提示MSCs在缺氧的環境下可能向血管內皮祖細胞或血管內皮細胞進行了分化。

2.5RT-PCR檢測結果

選取VEGF、bFGF、TGF-β、IL-1α作為檢測指標，以592 bp β-actin為內參，進行缺氧處理和正常培養MSCs的上述目的基因檢測。結果表明，VEGF、bFGF、TGF-β、IL-1α在缺氧處理的MSCs中有程度不同的表達，其中 IL-1α和 TGF-β表達較強，VEGF、bFGF表達增強；而正常培養的MSCs中，IL-1α未表達，VEGF、bFGF、TGF-β表達微弱（圖6，7）。

表1　引物序列Table 1　Primer sequence

圖1　倒置相差顯微鏡下原代接種24 h的MSCs（100×）Fig.1　P0 MSCs after 24 hours under inverted microscope(100×)

圖2　MSCs流式細胞學鑒定Fig.2　Identification of MSCs by flow cytometry

圖3　Ⅷ因子免疫組化染色（100×）Fig.3　Immunohistochemical staining of Ⅷfactor(100×)

圖4　Flk-1免疫熒光（100×）Fig.4　Immunofluorescence staining of Flk-1(100×)

圖5　雙熒光染色（100×）Fig.5　Double immunofluorescence staining(100×)

A：IL-1α；B：β-actin圖6　IL-1α在缺氧和未缺氧MSCs的表達Fig.6　Expression of IL-1α in MSCs under hypoxia and normaxia

圖7　TGF-β、VEGF和bFGF在缺氧和未缺氧MSCs的表達Fig.7　TGF-β,VEGF and bFGF in MSCs under hypoxia and normaxia

3　討論

目前，組織修復方法有很多，包括干細胞移植、生長因子修復、基因治療、激光物理治療和生物材料修復等多種方法。近年來，MSCs因其來源廣泛、獲取便利、擴增迅速、高可塑性等特點，被廣泛應用于各種損傷組織的修復。Ichioka等[6]將BMSCs于術后即刻皮下注射至小鼠背部任意皮瓣，隨后制造缺血再灌注模型，7 d后皮瓣的成活面積明顯增加，皮下、肌肉層下的肉芽組織厚度增加，熒光顯微鏡下觀察到移植的細胞出現在血管壁結構中。Kobayashi等[7]發現，BMSCs移植到鼠心肌缺血模型后，可分泌多種促血管生成因子并向內皮細胞分化，表明MSCs移植后可有效抑制損傷組織細胞凋亡、刺激細胞增殖和促進微血管再生。

利用MSCs移植修復成功的關鍵包含許多因素，其中損傷部位的微環境尤為重要，包括損傷部位生長因子的分泌、血液循環、滲透壓和氧濃度等[8]。從生命起源、胚胎發育過程來看，MSCs均是在低氧（相對體外環境）微環境中生存的，所以細胞在體內的氧張力是低于大氣中的氧張力的，同時機體病理狀態下組織氧張力將更低。一方面，缺血缺氧條件下，由于營養物質和氧氣的供給不足，會導致MSCs死亡和移植治療的失敗[9]，另一方面，近20年來，越來越多研究發現，低氧培養下的MSCs細胞增殖速率加快[10]，凋亡率降低，細胞遷移速度加快。目前，多認為低氧環境是通過調控缺氧誘導因子（HIFs）來影響細胞生長、生存、分化、增殖、凋亡等[11]。研究顯示，低氧處理后的MSCs用于治療損傷的腸上皮細胞時，可增加其生存及增殖能力[12]。Forte等[13]發現，在低氧環境下，MSCs可激活cMet蛋白，通過介導肝細胞生長因子，激活ERK1/2、p38有絲分裂原激活蛋白酶及PI3K/Akt信號通路，增強組織再生能力。Tawa等[14]發現，缺氧環境下MSCs可通過缺氧誘導因子（Hypoxia-inducible factor，HIF）增加血管內皮生長因子的表達來促進血管生成。這些均說明MSCs在低氧條件下被應用于組織修復時，不僅使得自身增殖能力增加，并可促進血管新生。同時，低氧也是血管生成的重要誘因之一[15]，表現為細胞的增殖能力增強，同樣培養時間下，細胞數量較正常高一倍左右；趨化和移行能力增強；成血管功能增強等[16]。

低氧培養的MSCs使得損傷部位局部血管化增強的同時，與血管形成相關的生長因子必然會有所改變。免疫組化及免疫熒光發現，缺氧處理24 h的 MSCs，其Ⅷ因子及Flk-1表達陽性。Flk-1也被稱為VEGFR-2（Vascular endothelial growth factor receptor），是一種Ⅲ型跨膜蛋白激酶，屬于酪氨酸激酶受體，主要表達在血管內皮細胞上，介導內皮細胞的增殖。Vladau等[17]通過抑制VEGF/VEGER作用，發現牙周組織血管內皮細胞數量減少，血管密度降低，損傷加重。Shalaby等[18]發現，Flk-1基因敲除小鼠由于造血和血管內皮細胞發育的缺陷，死于胚胎發育的8.0～8.5 d，均提示Flk-1對于血管內皮細胞的分化和增殖是必不可少的。Ⅷ因子是由內皮細胞分泌的凝血因子，也可作為內皮細胞的標志物，兩者陽性表達說明MSCs在缺氧的狀態下有向內皮細胞，特別是血管內皮轉化的趨勢。內皮祖細胞吞噬低密度脂蛋白（ac-LDL）是其重要的生物學功能之一，既往研究常以吞噬Dil標記乙酰化低密度脂蛋白能力作為鑒定內皮祖細胞的一個重要指標。本實驗中，Dilac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色發現，缺氧處理的MSCs很多表現為雙熒光染色陽性，說明其在缺氧狀態下很可能向內皮細胞或者內皮祖細胞轉化。

VEGF是目前公認的最具特異性，且作用最強的內源性血管生成因子，它必須與受體結合，才能實現其促血管內皮細胞有絲分裂的作用。在體外，VEGF是強有力的內皮細胞的有絲分裂原，在培養的內皮細胞中，VEGF可激動磷脂酶C、誘導Ca2+水平上調，刺激內皮細胞釋放von Willebrand因子，誘導組織對VEGF的活性表達。VEGF的分泌還影響血管內皮細胞的增殖及毛細血管網的形成。RTPCR發現，VEGF表達增加，作為血管化最具有代表性的因子，說明缺氧處理后的MSCs可使得組織血管化作用增強。有研究表明，MSCs移植可以上調局部VEGF的表達，VEGF水平上調可直接刺激內皮細胞的擴增與分化。目前已證實，VEGF主要通過VEGF受體2（即Flk-1）促進內皮細胞的移行能力，而低氧可增加內皮細胞的Flk-1表達[19]。研究發現，利用20%胎牛血清和5%O2培養MSCs后，其表達的VEGF-A增加，這和我們的實驗結果一致。VEGF表達的增強可進一步刺激內皮細胞生長，促進新生血管生成，有利于損傷和疾病恢復。但是，也有報道認為，單純使用VEGF或VEGF基因治療可能引起血管通透性增加、下肢水腫或局部血管過度增生等。

本實驗發現，在缺氧刺激下，MSCs的TGF-β的mRNA表達上調明顯。TGF-β不僅對血管新生和組織創傷有重大意義，還抑制T細胞活化，減輕免疫反應。Sanchez-Elsner等[20]發現，低氧環境下TGF-β可協同VEGF的表達來刺激血管生成。所以缺氧很可能通過刺激TGF-β和VEGF的表達，增加兩者間的協調作用來加強血管化作用。將臍帶來源間充質干細胞在缺氧條件下培養，發現TGF-β表達也增強[21]，與我們的結果是一致的。我們認為，經缺氧處理后的MSCs的TGF-β表達增加可以促進組織損傷的血液循環，治療與缺血相關的疾病。

同時，IL-1α也明顯上調。IL-1是一種強烈的促炎細胞因子，除調節T細胞和B細胞介導的免疫功能外，還作用于中性粒細胞、巨噬細胞及血管內皮細胞，在炎癥反應和炎癥損傷中起著重要作用，炎癥反應或炎癥損傷可誘使組織自身合成IL-1，通過自分泌或旁分泌的形式，使組織損傷加重。但IL-1還是重要的調節因子，可同時調節其他生長因子的表達。因此，IL-1在損傷中的作用可能是雙向性的。研究發現，IL-1α可通過刺激炎癥細胞和血管內皮細胞之間的VEGF-VEGFR-2信號通路誘發血管形成，表明其自身主要作用是增加炎癥反應，但同時可通過調節其他因子來誘發血管形成。利用低氧培養的人臍帶間充質干細胞修復小鼠后肢缺血肌肉時，發現炎癥因子IL-1、IL-12減少，說明IL-1的變化可能與細胞的培養方式，低氧處理時間長短，體內外環境的不同或者細胞來源有關。

將MSCs移植在受損皮膚中，發現MSCs可分化為真皮成纖維細胞，或通過其合成、分泌促進傷口愈合的細胞因子，如TGF-β和bFGF，然后合成膠原，通過其增殖、收縮等一系列活動，促進傷口愈合。另外，人們應用bFGF可以促進缺血皮瓣的血管生長，增強細胞對缺血缺氧的耐受，減輕皮瓣的缺血再灌注損傷。本實驗研究發現，其表達增強，說明bFGF在低氧條件下的表達升高可以刺激血管內皮細胞增殖和管腔形成，Naaldijik等[22]還發現bFGF可促進低氧培養下MSCs的細胞遷移。

綜上所述，我們發現缺氧處理后的MSCs有向血管內皮細胞或者內皮祖細胞分化的趨勢；另外，缺氧可刺激MSCs的VEGF、bFGF、TGF-β和IL-1α的表達，表明缺氧處理后的MSCs可通過上調血管因子的表達，來促進損傷組織血管化的形成，提高了組織對缺血的耐受能力，有利于組織損傷的修復及缺血缺氧相關疾病的治療。

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【中圖分類號】Q813.1+1

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）03－0147－05

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.001

作者單位：200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科；上海市組織工程研究重點實驗室。

通訊作者：余東（E-mail：drxuliang@126.com）。血缺氧環境并不利于MSCs的存活和修復。目前，大量研究證實，缺氧條件下培養的MSCs，其分化、增殖、遷移功能均可增強，并可促進損傷組織血管生長。所以，MSC移植后修復損傷部位的成功率與其低氧環境密切相關[5]。為明確MSCs在缺血缺氧環境中發生的改變，本實驗將MSCs在體外進行缺氧處理，觀察其細胞生物學特性，然后對相關生長因子進行檢測，旨在發現MSCs在缺血缺氧環境刺激下的細胞特性，以及分泌相關因子的改變，為臨床修復組織損傷及治療缺血缺氧性疾病提供依據。

The Gene Differential Expression of Mesenchymal Stem Cells Under Hypoxia

XU Liang,BAI Shanshan,DUAN Huichuan,YU Dong.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China.Corresponding authors:YU Dong(E-mail:drxuliang@126.com).

【Abstract】ObjectiveTo investigate the biological characteristics and related factors of mesenchymal stem cells(MSCs) under hypoxia and to extend the knowledge for repairing clinical tissue injury.MethodsMSCs were cultured and exposed to the hypoxic condition in vitro.The cell properties were observed by immunofluorescence staining,RT-PCR were performed to investigate the expression of VEGF、bFGF、TGF-β and IL-1α,in order to explore the changes of MSCs under hypoxia from the aspects of cell differentiation,related factors and cell signaling pathways.ResultsCultured under hypoxia for 24 hours,cells were observed under inverted microscope and survived well,and no significant changes of cell morphology and growth patterns were observed.Immunofluorescence and double immunofluorescence staining found out there was a tendency that MSCs cultured in hypoxia transform into endothelial cells,particularly vascular endothelial cells.The expression of VEGF,bFGF,TGF-β and IL-1α were all up-regulated in MSCs exposed to the hypoxic condition,but a weak expression in MSCs cultured in normoxia.ConclusionUnder the hypoxic condition,MSCs can differentiate into vascular endothelial cell, and expression of factors VEGF,bFGF,TGF-β and IL-1α,which can enhance the formation and growth of vascular,are all up-regulated,directly or indirectly accelerate the vascularization in tissue injury.

【Key words】Mesenchymal stem cells;Gene expression;Vascularization;Hypoxia