骨髓基質干細胞擴增體系研究

王婷婷　何愛娟　劉豫　曹誼林　唐勝建　周廣東

·論著·

骨髓基質干細胞擴增體系研究

王婷婷何愛娟劉豫曹誼林唐勝建周廣東

【摘要】目的比較三種不同培養體系對人骨髓基質干細胞（hBMSCs）增殖能力、表面標志和分化潛能的影響，探索hBMSCs適合的培養體系。方法獲取hBMSCs，分別用DMEM、DMEM+堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和無動物組份的間充質干細胞培養基（Mesenchymal Stem Cell Medium-animal component free，MSCM-acf）進行培養，反復傳代至第6代，分別計數每種培養體系每個代次的細胞得率。取第4～6代細胞，用流式細胞儀對細胞表面標志進行檢測，同時對各組第6代細胞分別向成軟骨、成脂和成骨方向進行誘導分化。結果培養至第2代后，MSCM-acf培養體系細胞得率顯著大于其他兩組；流式細胞分析結果表明，MSCM-acf培養體系表面陽性標志CD73、CD90和CD105均大于99%，總的陰性標志表達小于2%，優于其他兩組，尤其是DMEM+bFGF培養體系；三組均保留了多向分化潛能，添加bFGF的培養體系成軟骨分化明顯優于其他兩組，MSCM-acf培養體系成脂和成骨分化優于其他兩組。結論MSCM-acf培養體系可以實現hBMSCs干性維持下的大量擴增，是hBMSCs較為理想的培養體系。

【關鍵詞】骨髓基質干細胞培養體系細胞表面標志分化潛能

人骨髓基質干細胞（hBMSCs）取材創傷小，可以進行體外擴增，不易變異，且具有多向分化潛能，抗原性小，修復能力強等優點，是組織工程非常有應用前景的種子細胞[1]。但是，hBMSCs體外大量擴增易發生老化及自發分化[2]，其干細胞相關表面標志物受不同培養體系的影響也會發生很大變化，進而影響其干性及多向分化潛能[3-4]。因此，實現干性維持前提下的大量擴增，是hBMSCs研究及臨床應用轉化所面臨的關鍵問題[5]。

目前，已報道的不同培養體系對hBMSCs擴增培養和分化潛能有很大影響[6]。常用的hBMSCs培養擴增體系主要是基于DMEM添加胎牛血清（FBS）的培養體系，受胎牛血清復雜成分的影響[7]，易出現自發分化，喪失干性及多向分化潛能，且多次傳代擴增后增殖能力顯著下降。此外，由于胎牛血清中異種蛋白的存在，使其在臨床應用中存在局限性[8]。研究證實，在培養體系中添加bFGF可實現hBMSCs大量擴增，并保留其一定的干性及多向分化潛能。但也有研究表明，bFGF對hBMSCs干細胞相關表面標志有顯著影響，如顯著降低CD90和CD105的表達[4]，而且含bFGF的培養體系仍有胎牛血清成分。

無血清培養體系組成明確，不含胎牛血清成分，無異種蛋白影響，培養體系不同批次成分穩定，可重復性強。我們前期研究發現，無血清培養體系MSCM-acf可促進hBMSCs的大量擴增，但對于細胞表面標志和分化潛能的影響尚無系統的研究。

本實驗旨在探討MSCM-acf無血清培養體系在細胞得率、表面標志的表達水平和分化潛能方面是否具有明顯優勢。

1　材料和方法

1.1臨床資料、試劑與儀器

骨髓取自上海第六人民醫院行髖關節置換手術的患者，共9例，每例5 mL。患者平均年齡（50±5）歲。所有患者對實驗知情同意，并簽署知情同意書。

DMEM，0.25%胰酶（Gibco公司，美國）；胎牛血清，磷酸鹽緩沖液（Hyclone公司，美國）；bFGF，Human MSC Analysis Kit，流式細胞儀（B&D公司，美國）MSCM-acf（ScienCell，美國）；油紅O染液、甲苯胺藍染液、茜素紅染液（武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1實驗分組

對照組1：DMEM培養體系 （含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/mL）；對照組2：DMEM+ bFGF培養體系（含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/mL，bFGF 5 ng/mL）；實驗組：MSCM-acf培養體系。

1.2.2hBMSCs培養

標本離心管中加入含10%FBS的DMEM培養液40 mL，混勻制成細胞懸液，1 900 r/min離心8 min，輕輕吸除脂肪及大部分上清液，振蕩，細胞重懸，接種于100 mm培養皿，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度條件下培養，5 d后首次換液，待細胞80%融合時，0.25%胰酶消化，收集細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，計數，分別用三種培養液重懸，按0.5×106個有核細胞接種于100 mm培養皿。2～3 d可達到80% ～90%的融合度，再次傳代培養。每次傳代時觀察細胞形態變化，并計數細胞得率。

1.2.3流式細胞檢測hBMSCs表面標志

分別取三個培養體系的第4～6代hBMSCs，0.25%胰酶消化，離心，用緩沖液重懸，計數調整細胞濃度為2×106cells/mL，按照Human MSC Analysis Kit說明，取100 μL細胞懸液分別與CD90、CD73、CD105、CD34、CD45、CD11b和HLA-DR單克隆抗體室溫避光孵育30 min，緩沖液洗滌3遍，每種樣品重懸成300 μL，待上機。

1.2.4hBMSCs的誘導分化

分別取三個培養體系的第6代細胞，向成軟骨、成脂和成骨方向進行誘導分化。3周后分別用甲苯胺藍、油紅O和茜素紅染色。

2　結果

2.1三組培養體系中hBMSCs的形態變化

光鏡下觀察到對照組1細胞生長較為緩慢、稀疏，細胞胞體較大，凸起較為明顯；對照組2的細胞低代次胞體較小，隨代次增加呈長梭型改變，邊緣較銳利；實驗組細胞比對照組1的低代次細胞體積更小，成多角形，而且隨傳代次數增加，細胞凸起增多，凸起較短。表明MSCM-acf培養體系能更好地維持hBMSCs的細胞形態（圖1）。

2.2hBMSCs細胞得率

本實驗中hBMSCs的擴增基數均為0.5×106個有核細胞，各組前兩代細胞擴增無明顯差異。第3～6代中，實驗組、對照組2細胞得率均高于對照組1。第6代時，實驗組細胞得率平均達到230×106個，遠高于對照組2（110×106個）。表明MSCM-acf培養體系在保持細胞良好形態的同時，顯著促進細胞增殖（圖2）。

2.3hBMSCs表面標志檢測

經流式細胞儀檢測，實驗組hBMSCs表面陽性標記物CD90、CD73和CD105的表達程度均>99%，CD45、CD11b和HLA-DR等陰性標志物的表達總數<2%，明顯優于對照組。實驗組2陽性標記物CD90 和CD105的表達明顯低于實驗組1，兩組CD73的表達沒有差別；而陰性標志物的表達實驗組2遠大于實驗組1，且兩組均>2%。表明MSCM-acf培養體系能更好地維持hBMSCs的干性（圖3-4）。

2.4hBMSCs的誘導分化

2.4.1成軟骨分化

hBMSCs成軟骨分化3周后，甲苯胺藍染色顯示三組細胞核均藍染，對照組2染色偏深。表明三組培養體系均保留成軟骨分化潛能，對照組2成軟骨能力比其他兩組強（圖5）。

2.4.2成脂分化

hBMSCs成脂誘導3周后，三組細胞逐漸由長梭形變成多邊形、橢圓形等脂肪樣細胞形態，停止生長，細胞中均出現脂肪顆粒，油紅O染色顯示三組均呈現橘紅色脂滴。對照組1、2間無明顯差異，但脂滴較小，數目較少。單個細胞中，實驗組脂滴顆粒比對照組多，且體積明顯增大。表明MSCM-acf培養體系能更好地促進成脂分化（圖5）。

2.4.3成骨分化

成骨誘導3周后，三組細胞均聚集成團，有結晶樣物質出現，茜素紅染色均呈現紅色鈣結節。實驗組呈現大量鈣結節，對照組1、2鈣結節不明顯。表明MSCM-acf培養體系可更好地促進成骨分化（圖5）。

圖1　hBMSCs在三種培養體系連續傳代培養下的形態觀察（40×）Fig.1　Morphological observation of hBMSCs under successively passaged culture in three expansion systems(40×)

圖2　hBMSCs在三組培養體系中的細胞得率Fig.2 Cell yield of hBMSCs in three expansion systems

圖3　第4～6代hBMSCs在三組培養體系中的CD90、CD105、CD73和所有陰性標志的表達百分比Fig.3　The percentage of fluorescence of CD90,CD105,CD73 and all the negative cocktails of P4-P6 hBMSCs in three expansion systems

圖4MSCM-acf培養體系中第6代hBMSCs表面標志物的表達Fig.4　The cell surface marker expression profile of P6 hBMSCs with expansion system of MSCM-acf

圖5　三種培養體系中第6代hBMSCs分別誘導成軟骨、成脂和成骨分化（100×）Fig.5　Chondrogenic differentiation,adipogenic differentiation and osteogenic differentiation of P6 hBMSCs in three expansion culture conditions(100×)

3　討論

hBMSCs是組織工程與再生醫學領域最具應用前景的種子細胞之一[9-10]。如何在維持干性的前提下大量擴增，是制約其發展與應用的重要問題[11-13]。研究表明，MSCM-acf培養體系能有效地實現hBMSCs大量擴增，擴增細胞穩定表達干細胞相關表面標志，且保留了良好的軟骨、脂肪、骨多向分化潛能，細胞得率和干性維持顯著，優于傳統的含血清培養體系及基于bFGF的擴增體系。提示MSCM-acf是一種具有臨床應用前景的hBMSCs培養擴增體系。

本實驗結果表明，在MSCM-acf培養體系中，第2代后的細胞得率均大于傳統含血清的DMEM培養體系和基于bFGF的擴增體系。第1、2代三個培養體系的細胞得率無明顯差異，可能是低代次的細胞干性較好，受培養體系的影響小。自第2代起，細胞在無血清培養體系中的增殖明顯高于其他兩組，第6代細胞得率平均達到230×106個，且傳代后細胞形態未發生明顯變化。可能是在這種培養體系中，添加了類似血清替代品或bFGF等促細胞增殖的一系列因子，無異源蛋白成分，加之這種培養液成分固定，可以穩定維持細胞的干性。我們的前期研究發現，不同批號甚至同一批號不同批次的血清成分不穩定，使得DMEM培養體系易受血清的影響，而發生老化和自發分化，從而減弱細胞的增殖能力。DMEM+bFGF培養體系雖然添加了bFGF，可刺激細胞增殖，但成分單一，無法滿足細胞大量擴增需要。

hBMSCs干細胞相關表面標志的表達是反應干性的重要指標，表達水平對于細胞維持多向分化潛能有很大影響[3-4]。影響細胞表面標志表達的因素是多方面的，其中血清是一個很重要的影響因素，因其成分復雜，不可控，不能穩定維持細胞的干性，進而影響細胞表面標志的表達。本實驗應用的無血清培養體系MSCM-acf可實現細胞表面標志穩定均一表達，陽性標志CD90、CD105和CD73表達均達到99%以上，所有陰性指標的表達總數<2%，并且代次間無明顯變化。該結果符合MSCs定義的最低標準：表達CD105、CD73和CD90，不表達CD45、CD34、CD14、CD11b和HLA-DR[9，14]。而DMEM培養體系達不到上述標準，尤其是添加 bFGF后，CD90和CD105的表達明顯下調，陰性標志的表達總數平均達到40%。本實驗結果與文獻報道一致[3]。

hBMSCs多向分化潛能是反應其干性的另一重要指標。在MSCM-acf培養體系中，成脂分化，脂滴的數目更多，體積更大；成骨分化，鈣結節更多；成脂和成骨分化優于含血清的DMEM培養體系。DMEM+bFGF培養體系成軟骨分化較為明顯，這一結果同樣與文獻報道一致[3]；DMEM培養體系中，由于細胞干性的逐步喪失，因此失去了良好的分化潛能。這一結果表明，細胞在無血清培養體系中可以更好地維持細胞的干性，進而穩定維持其分化潛能。

綜上所述，無血清培養體系MSCM-acf能長期維持hBMSCs的干性并大量快速擴增，同時使細胞表面標志高度均一表達，解決了細胞表面標志不穩定表達的難題，也充分維持了細胞多向分化的潛能。因此，MSCM-acf是hBMSCs較為理想的培養體系。

參考文獻

[1]Le Black K,Rasmusson I,Sundberg B,et al.Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third partyhaploidential mesenchymal stem cells[J].Lancent,2004,363(6):1439-1441.

[2]Maurer MH.Proteomic definitions of mesenchymal stemcells[J]. Stem Cells Int,2011,2011:704256.

[3]Hagmann S,Moradi B,Frank S,et al.FGF-2 addition during expansion of human bone marrow-derived stromal cells alters MSC surface marker distribution and chondrogenic differentiation potential[J].Cell Prolif,2013,46(4):396-407.

[4]滕勇,徐建麗,李旭升,等.人骨髓基質干細胞的單細胞克隆培養與鑒定[J].中國組織工程研究,2012,16(10):1742-1747.

[5]Bara JJ,Richards RG,Alini M,et al.Concise review:Bone marrowderived mesenchymal stem cells change phenotype following in vitro culture:implications for basic research and the clinic[J]. Stem Cell,2014,32(7):1713-1723.

[6]Hagmann S,Moradi B,Frank S,et al.Different culture media

affect grow th characteristics,surface marker distribution and chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells[J].BMC Musculoskelet Disord,2013, 14:223.

[7]Sotiropoulou PA,Perez SA,Salagianni M,et al.Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells[J].Stem Cells,2006,24(2):462-471.

[8]Jung S,Panchalingam KM,Rosenberg L,et al.Ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells in defined serum-free media [J].Stem Cells Int,2012,2012:123030.

[9]Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy, 2006,8(4):315-317.

[10]Ankrum J,Karp JM.Mesenchymal stem cell therapy:Two steps forward,one step back[J].Trends Mol Med,2010,16(5):203-209.

[11]Li G,Chan CY,Wang H,et al.Proteomic analysis of human mesenchymal stem cells[J].Methods Mol Biol,2011,698:443-457.

[12]Gharibi B,Hughes FJ.Effects of medium supplements on proliferation,differentiation potential,and in vitro expansion of mesenchymal stem cells[J].Stem Cells Transl Med,2012,1(11): 771-782.

[13]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284 (5411):143-147.

[14]Lv FJ,Tuan RS,Cheung KM,et al.Concise review:the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells[J].Stem cells,2014,32(6):1408-1419.

·論著·

【中圖分類號】Q813.1+1

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）03－0152－05

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.002

作者單位：261042山東省濰坊市濰坊醫學院整形外科研究所（王婷婷，唐勝建，周廣東）；200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科，上海市組織工程研究重點實驗室（王婷婷，何愛娟，劉豫，曹誼林，周廣東）；200241上海市組織工程國家工程研究中心（王婷婷，何愛娟，劉豫，曹誼林，周廣東）。

通訊作者：周廣東（E-mail：guangdongzhou@126.com）。

收稿日期：（2016年2月26日；修回日期：2016年4月19日）

Research on the Amplification System of Bone Marrow Stromal Stem Cells

WANG Tingting1,2,3,HE Aijuan2,3,LIU Yu2,3,CAO Yilin2,3,TANG Shengjian1,ZHOU Guangdong1,2,3.1 Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College, Weifang 261042,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery;Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;3 National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241,China.Corresponding author:ZHOU Guangdong(E-mail: guangdongzhou@126.com).

【Abstract】ObjectiveTo compare the effects of three different culture systems on the proliferation ability,surface marker and differentiation potential of bone marrow stromal stem cells(hBMSCs),and to explore a suitable expansion system for hBMSCs.MethodshBMSCs were obtained and cultured respectively in three culture systems:DMEM,DMEM+basic fibroblast growth factor(bFGF)and Mesenchymal Stem Cell Medium-animal component free(MSCM-acf),to the sixth generation of repeated passages.The cell yield of each culture system for each rate was counted.Cell surface markers of P4-P6 were detected using flow cytometry.At the same time,hBMSCs of P6 in each culture system were induced for chondrogenic differentiation,osteogenic differentiation and adipogenic differentiation.ResultsThe cell yield in MSCM-acf group was far greater than that of the other two groups;The positive indicators of hBMSCs were detected by flow cytometry, in MSCM-acf group,CD73,CD90 and CD105 were all greater than 99%,the sum of negative cocktails was lower than 2%, which showed better results compared with the other two groups,especially DMEM+bFGF group.All of the three groups had the potential of differentiation.Cartilage differentiation in DMEM+bFGF was better.Adipogenic differentiation and osteogenic differentiation in MSCM-acf group were better than the other two expansion systems.ConclusionMSCM-acf expansion system can achieve a large number of hBMSCs amplification,and maintain the activity of cells.Therefore,MSCM-acf can be considered as an ideal hBMSCs expansion system.

【Key words】Bone marrow stromal stem cells;Expansion system;Surface marker;Differentiative potential