轉(zhuǎn)化生長因子β1的關(guān)鍵序列篩選及鑒定

宗憲磊　李國菊　靳小雷　姜篤銀

·論著·

轉(zhuǎn)化生長因子β1的關(guān)鍵序列篩選及鑒定

宗憲磊李國菊靳小雷姜篤銀

【摘要】目的應(yīng)用噬菌體隨機(jī)12肽庫，篩選轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor-beta1，TGF-β1）的關(guān)鍵序列，進(jìn)行TGF-β1活性短肽的合成，并檢測(cè)其與成纖維細(xì)胞的親和力。方法以TGF-β1單克隆抗體為靶，篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫，獲得TGF-β1的特異性序列。進(jìn)行序列比對(duì)分析，選擇TGF-β1的關(guān)鍵序列。進(jìn)行TGF-β1活性短肽的合成、純化、修飾及免疫熒光標(biāo)記。應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)TGF-β1活性短肽的成纖維細(xì)胞親和力。結(jié)果篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫，獲得10個(gè)與TGF-β1相似的特異性序列。分析獲得7個(gè)TGF-β1的關(guān)鍵序列。合成獲得7個(gè)TGF-β1活性短肽，并純化至98%，短肽的C端進(jìn)行氨基化封閉，N端進(jìn)行羅丹明激光染料標(biāo)記。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，1個(gè)TGF-β1活性短肽能夠與成纖維細(xì)胞相結(jié)合。結(jié)論從噬菌體隨機(jī)12肽庫中篩選到TGF-β1的關(guān)鍵序列，1個(gè)TGF-β1活性短肽能夠與成纖維細(xì)胞相結(jié)合，有望應(yīng)用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合的相關(guān)研究。

【關(guān)鍵詞】噬菌體隨機(jī)12肽庫轉(zhuǎn)化生長因子β1活性短肽成纖維細(xì)胞

轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factorbeta 1，TGF-β1）是一種多功能的生長因子，與創(chuàng)面愈合、胚胎發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合，增加組織的抗張強(qiáng)度[1]。局部應(yīng)用生長因子有助于促進(jìn)創(chuàng)面愈合，但是現(xiàn)有的生長因子產(chǎn)品存在很多缺點(diǎn)，限制了生長因子的廣泛應(yīng)用。目前，寡肽和多肽的研究及應(yīng)用備受矚目，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值[2]。噬菌體隨機(jī)肽庫是呈現(xiàn)特定長度的各種不同外源性多肽的噬菌體集合物。噬菌體隨機(jī)肽庫涵蓋性好，已廣泛應(yīng)用于抗原表位的模擬和蛋白質(zhì)工程的改造等方面，特別是小分子活性肽的展示，可用于研制新型創(chuàng)面藥物和受體激動(dòng)劑[3]。我們?cè)谇捌诠ぷ髦校褟氖删w隨機(jī)12肽庫中篩選獲得TGF-β1的特異性序列[4-5]。本研究擬進(jìn)行TGF-β1關(guān)鍵片段的分析和選取，進(jìn)行TGF-β1活性短肽的合成，并檢測(cè)其與成纖維細(xì)胞的親和力，為TGF-β1的結(jié)構(gòu)調(diào)整和生產(chǎn)方法開拓新的思路。

1　材料和方法

1.1主要試劑和儀器

噬菌體隨機(jī)12肽庫試劑盒（NEB公司，美國），TGF-β1（Peprotech公司，美國），TGF-β1單克隆抗體（R&D公司，美國），TGF-β1 ELISA試劑盒（上海Sunbio公司），D-PBS、PBS、DMEM、FBS、胰蛋白酶（Hycolone公司，美國），DMSO（Sigma公司，美國），免疫熒光檢測(cè)試劑盒 （武漢博士德公司），酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國），超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERAEUS公司，德國）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1TGF-β1特異性序列篩選

以人TGF-β1單克隆抗體包被96孔板，添加噬菌體隨機(jī)12肽庫孵育，TBST洗板10次，洗脫緩沖液（0.2 mol/L Glycine-HCl，pH 2.2，0.1%BSA），洗脫結(jié)合的噬菌體，中和緩沖液 （1 mol/L Tris-HCl，pH 9.1），快速中和洗脫物。應(yīng)用E.coli ER2738宿主菌對(duì)洗脫物進(jìn)行擴(kuò)增，用于下一輪篩選。同樣方法對(duì)每輪的洗脫物再進(jìn)行三輪篩選。對(duì)第四輪的洗脫物進(jìn)行滴度測(cè)定，隨機(jī)挑選噬菌體藍(lán)斑，進(jìn)行擴(kuò)增，調(diào)整至2.0×1013pfu/mL。應(yīng)用ELISA方法和人TGF-β1免疫測(cè)定試劑盒檢測(cè)單克隆噬菌體的結(jié)合力。挑選結(jié)合力好的噬菌體，應(yīng)用碘化物緩沖液法提取噬菌體DNA，送北京華大基因有限公司進(jìn)行染料示蹤的雙脫氧法自動(dòng)測(cè)序。應(yīng)用核酸Blast系統(tǒng)檢測(cè)模擬肽DNA的相似性[4-5]。 1.2.2TGF-β1關(guān)鍵片段分析與選取

將篩選獲得的10個(gè)特異性氨基酸序列逐一與TGF-β1的氨基酸序列相對(duì)比，特異性氨基酸序列在TGF-β1蛋白中集中出現(xiàn)于多個(gè)部位，選取這些相對(duì)集中的氨基酸序列片段。

1.2.3TGF-β1活性短肽合成

送武漢明皓生物科技有限公司進(jìn)行TGF-β1活性短肽的合成，純化至98%，然后對(duì)短肽的C端進(jìn)行氨基化封閉，對(duì)短肽的N端進(jìn)行羅丹明激光染料標(biāo)記。制備成凍干粉，-20℃保存。

1.2.4細(xì)胞系和培養(yǎng)方法

采用組織塊培養(yǎng)法獲得第3～5代正常皮膚成纖維細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)方法：應(yīng)用DMEM和10% 的FBS于37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基添加100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素。1.2.5細(xì)胞結(jié)合性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)共設(shè)7組：TGF-β1活性短肽組 （No.1-No. 7）。將成纖維細(xì)胞種植于24孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用DMEM+10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后換液，應(yīng)用DMEM+0.5%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)，于7組中分別添加TGF-β1活性短肽（No.1-No.7，濃度為0.5 ng/mL），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，應(yīng)用D-PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定0.5 h。嚴(yán)格按照免疫熒光檢測(cè)試劑盒的操作說明進(jìn)行操作。

2　結(jié)果

2.1TGF-β1特異性序列篩選

通過對(duì)噬菌體隨機(jī)12肽庫篩選，獲得TGF-β1特異性的噬菌體模擬肽，對(duì)噬菌體DNA樣本進(jìn)行測(cè)序，獲得10個(gè)特異性的堿基序列和氨基酸序列[4-5]（表1）。

2.2TGF-β1序列分析及關(guān)鍵片段選取

將篩選獲得的氨基酸序列與TGF-β1的氨基酸序列相對(duì)比，共發(fā)現(xiàn)7個(gè)相對(duì)集中的氨基酸序列片段。選取這7個(gè)氨基酸序列，進(jìn)行活性短肽的合成，進(jìn)一步鑒定和篩選TGF-β1的關(guān)鍵片段（表2）。

2.3TGF-β1活性短肽合成

完成7個(gè)TGF-β1活性短肽的合成，并純化至98%，對(duì)TGF-β1活性短肽的C端進(jìn)行氨基化封閉，增強(qiáng)短肽的穩(wěn)定性，對(duì)短肽的N端進(jìn)行羅丹明激光染料標(biāo)記，用于鑒定活性短肽能否與成纖維細(xì)胞上的特異性受體相結(jié)合。制成凍干粉，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4細(xì)胞結(jié)合性檢測(cè)

應(yīng)用7種TGF-β1活性短肽對(duì)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，因TGF-β1活性短肽應(yīng)用羅丹明激光染料進(jìn)行了標(biāo)記，免疫熒光檢測(cè)的結(jié)果顯示1種 TGF-β1活性短肽（No.2）干預(yù)的成纖維細(xì)胞能夠染色，表明該段氨基酸序列為TGF-β1的關(guān)鍵片段（圖1）。

表1　DNA測(cè)序結(jié)果Table 1　The results of DNA sequencing

表2　TGF-β1活性短肽的序列選取和設(shè)計(jì)Table 2　The selection and design of TGF-β1 bioactive peptides

圖1　TGF-β1活性短肽的免疫熒光測(cè)定（200×）Fig.1　The immunofluorescence assay of TGF-β1 bioactive peptides(200×)

3　討論

創(chuàng)面愈合過程包括細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和可溶性分子之間復(fù)雜的相互作用，生長因子是其中不可或缺的因素。TGF-β1是一種促進(jìn)創(chuàng)口縮合的重要因子，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，膠原形成和沉積，細(xì)胞外基質(zhì)平衡，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌纖維母細(xì)胞[6]。高壓脈沖電流刺激能夠增強(qiáng)TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)Ⅰ膠原蛋白的合成，使創(chuàng)面明顯縮合，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[7]。STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠表達(dá)TGF-β1降低，局部應(yīng)用TGF-β1能夠促進(jìn)血管再生和創(chuàng)面愈合[8]。創(chuàng)傷早期應(yīng)用TGF-β1能夠誘導(dǎo)早期上皮化，促進(jìn)膠原沉積，使炎癥細(xì)胞浸潤減少，促進(jìn)創(chuàng)面血管化，創(chuàng)面更早重塑。TGF-β1處理后的脂肪干細(xì)胞能夠上調(diào)Ⅰ型膠原蛋白和MMP-1的表達(dá)，促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞遷移，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[9]。應(yīng)用電穿孔法導(dǎo)入TGF-β1質(zhì)粒，能夠增強(qiáng)糖尿病模型創(chuàng)面的再上皮化、膠原合成和血管化，從而提高了治愈率。廣譜的MMP抑制劑BB-94能夠抑制TGF-β1的活性，抑制TGF-β1誘導(dǎo)肌纖維母細(xì)胞形成的作用，從而延緩創(chuàng)口縮合[10]。

局部應(yīng)用生長因子有助于促進(jìn)創(chuàng)面愈合，但是現(xiàn)有的生長因子產(chǎn)品存在很多缺點(diǎn)，包括：①需要應(yīng)用動(dòng)物載體進(jìn)行生產(chǎn)，存在倫理學(xué)和疾病傳播等問題，且產(chǎn)量較低，生產(chǎn)成本較高，導(dǎo)致價(jià)格昂貴；②分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，作用多樣化，難以控制，至今生長因子的體內(nèi)應(yīng)用未獲國家批準(zhǔn)通過；③穩(wěn)定性差，易受到創(chuàng)面局部微環(huán)境的影響，易降解失活，生物半衰期短，作用時(shí)間短，需大劑量反復(fù)應(yīng)用才能達(dá)到預(yù)期的治療效果，加重了創(chuàng)面損傷和患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。這些因素限制了生長因子的廣泛應(yīng)用。目前，寡肽和多肽的研究及應(yīng)用備受矚目，合成的肽相對(duì)于天然蛋白，具有很多優(yōu)點(diǎn)，包括：①分子量小，作用單一，并可進(jìn)行結(jié)構(gòu)調(diào)整，增強(qiáng)短肽的穩(wěn)定性和性能；②可直接大量合成制備，生產(chǎn)成本較低；③不需要借助動(dòng)物載體進(jìn)行生產(chǎn)，避免了倫理學(xué)問題和疾病傳播。因此，這類產(chǎn)品具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[2]。

基于上述原因，我們?cè)谇捌谘芯抗ぷ髦幸褢?yīng)用TGF-β1單克隆抗體，從噬菌體隨機(jī)12肽庫中篩選獲得特異性序列[4-5]。將篩選獲得的氨基酸序列與TGF-β1的蛋白對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)相對(duì)集中的氨基酸序列，這些氨基酸序列中可能存在TGF-β1的關(guān)鍵片段，形成TGF-β1的空間構(gòu)象，發(fā)揮其生物學(xué)作用。為了從這7個(gè)氨基酸序列中進(jìn)一步篩選鑒定TGF-β1的關(guān)鍵片段，我們進(jìn)行了活性短肽的合成。為了增強(qiáng)活性短肽的穩(wěn)定性，對(duì)短肽的C端進(jìn)行氨基化封閉。為了鑒定活性短肽能否與成纖維細(xì)胞上的特異性受體相結(jié)合，對(duì)短肽的N端進(jìn)行了羅丹明激光染料標(biāo)記。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，第2組的成纖維細(xì)胞能夠顯色，表明選取的第2個(gè)氨基酸序列是TGF-β1的關(guān)鍵片段，形成了TGF-β1的空間構(gòu)象，能夠與成纖維細(xì)胞上的特異性受體相結(jié)合。在后期的實(shí)驗(yàn)中，需要對(duì)短肽的N端進(jìn)行乙酰化封閉，進(jìn)一步增強(qiáng)短肽的穩(wěn)定性。本研究還需要進(jìn)行離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步檢測(cè)TGF-β1的生物學(xué)性能。

4　結(jié)論

①篩選獲得了TGF-β1的關(guān)鍵片段，有助于了解TGF-β1的結(jié)構(gòu)；②如果TGF-β1活性短肽能夠產(chǎn)生類似于TGF-β1的生物學(xué)作用，有望用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合，為生長因子的結(jié)構(gòu)調(diào)整和生產(chǎn)方法開拓新的思路，具有科學(xué)研究價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。

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【中圖分類號(hào)】Q813.1+1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673－0364（2016）03－0156－04

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.003

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30772258，81201467）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2011HM027）。

作者單位：100144北京市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院（宗憲磊，靳小雷）；250014山東省濟(jì)南市山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院放射科 （李國菊）；250033山東省濟(jì)南市山東大學(xué)第二醫(yī)院美容整形燒傷外科、急診科，山東大學(xué)組織工程研究所（姜篤銀）。

通訊作者：靳小雷（E-mail：jinyuyizxyy@126.com）；姜篤銀（E-mail：jdybs2@vip.163.com）。

收稿日期：（2016年3月6日；修回日期：2016年4月28日）

The Biopanning and Appraisal of Key Sequence of Transforming Growth Factor-beta 1

ZONG Xianlei1,LI Guojv2, JIN Xiaolei1,JIANG Duyin3.1 Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy Medical Sciences,Beijing 100144,China;2 Department of Radiology,School of stomatology,Shandong University,Jinan 250012,China;3 Department of Plastic and Burn Surgery,and Emergency,The Second Hospital of Shandong University,Institute of Tissue Engineering of Shandong University,Jinan 250033,China.Corresponding author:JIN Xiaolei(E-mail:jinyuyizxyy@126.com);JIANG Duyin(E-mail: jdybs2@vip.163.com).

【Abstract】ObjectiveTo isolate key sequences from a phage display 12-mer peptide library,synthesize transforming growth factor-beta1(TGF-β1)bioactive peptides and evaluate the fibroblasts affinity of TGF-β1 bioactive peptides. MethodsUsing monoclonal anti-human TGF-β1 antibody as the target,a phage display 12-mer peptide library was screened and target sequences were isolated.The key sequences of TGF-β1 were chosen.The key sequences were then modified to generate TGF-β1 bioactive peptides.Immunofluorescence assay was performed to evaluate the fibroblasts affinity of TGF-β1 bioactive peptides.ResultsTen peptides similar to TGF-β1 were isolated from a phage display 12-mer peptide library.Seven key sequences of TGF-β1 were chosen and then modified to generate TGF-β1 bioactive peptides.TGF-β1 bioactive peptides were then purified to reach a purity of 98%.The C terminal of TGF-β1 bioactive peptides was closed,and the N terminal was labeled with rhodamine dye laser.Immunofluorescence assay showed one TGF-β1 bioactive peptides was able to combine with the fibroblasts.ConclusionThe key sequences of TGF-β1 can be screened from a phage display 12-mer peptide library.One TGF-β1 bioactive peptides can combine with the fibroblasts.The results are expected to help promoting wound healing.

【Key words】Phage display 12-mer peptide library;Transforming growth factor-beta 1;Bioactive peptide;Fibroblast