化學發光免疫法檢測醛固酮和腎素濃度及對原發性醛固酮增多癥診斷價值的評價

王芳，康金鎖，鄒玉寶，蔣雄京，叢祥鳳，陳曦

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化學發光免疫法檢測醛固酮和腎素濃度及對原發性醛固酮增多癥診斷價值的評價

王芳，康金鎖，鄒玉寶，蔣雄京，叢祥鳳，陳曦

摘要

目的：對化學發光免疫法（CLIA）檢測醛固酮和腎素濃度進行方法學評價，并通過和放射免疫法（RIA）比較評價其對原發性醛固酮增多癥（原醛） 的診斷價值。

方法：依據美國臨床實驗室標準化協會的相關方案，對CLIA檢測醛固酮和腎素濃度的精密度、準確性、線性范圍及參考值范圍進行評價和驗證，同時對40例高血壓原因待查患者分別用RIA和CLIA檢測腎素活性或腎素濃度及醛固酮濃度，以臨床診斷為金標準，比較兩種方法測得的醛固酮濃度/腎素活性或濃度的比值（ARR或ADRR）用于原醛診斷的特異性和敏感性。

結果：CLIA檢測醛固酮和腎素濃度的批內和批間精密度分別小于5%和10%；回收率分別為102%和95%；醛固酮濃度在3～74 ng/dl范圍內、腎素濃度在0.99～330.00 μIU/ml范圍內，線性關系良好；20例健康受試者除2例腎素濃度超過參考值范圍，20例醛固酮濃度和ADRR均在廠商提供的正常人參考范圍內。高血壓原因待查患者的篩查試驗結果顯示CLIA和RIA的檢測敏感性相同，為85.7%，特異性則分別為97.0%和94.0%。

結論：CLIA具有操作簡單、重復性好、無放射性污染等優點，CLIA的檢測結果符合臨床要求，廠商提供的正常參考值范圍可用于臨床，本研究推薦用CLIA替代RIA。

關鍵詞 醛固酮增多癥；化學發光測定法；腎素；醛固酮

Objective： To evaluate chemiluminescence immunoassay （CLIA） for detecting blood levels of aldosterone and rennin with its diagnostic value of primary aldosteronism （PA） with comparison to radio immunoassay （RIA）.

Methods： According to American protocols of CLSI， we conducted a verification study between RIA and CLIA for their precision， accuracy， linearity and reference ranges； meanwhile， taking clinical diagnosis as golden standard， examined renin activity or concentration and aldosterone concentration in 20 healthy volunteers and 40 hypertension patients by both RIA and CLIA， compared the ratios of ARR （aldosterone concentration/renin activity） or ADRR （aldosterone concentration/renin concentration） for the specificity and sensitivity of PA diagnosis.

Results： Within-lot and between-lot accuracies of CLIA for detecting aldosterone levels were below 5% and 10%， the recoveries were 102% and 95% respectively. There was a good linear correlation in the range of aldosterone at （3-74） ng/dl and renin at （0.99-330） μIU/ml. In healthy volunteers， renin level was higher in 2 subjects， while aldosterone level and ADRR ratio were within normal references in all subjects by the manufacturer. In hypertension patients， the sensitivity and specificity for aldosterone and rennin detections by CLIA were at 85.7% and 97.0%， by RIA were at 85.7% and 94.0%.

Conclusion： CLIA has the superiority of simple performance， repeatable and without radioactive contamination； it isrecommended for replacing RIA as necessity.

Key words Primary adlosteronism；Chemiluminescence immunoassay： Renin；Aldosterone

（Chinese Circulation Journal， 2016，31：606.）

原發性醛固酮增多癥（原醛）是繼發性高血壓的常見原因之一，是由于腎上腺皮質腺瘤或增生，過量分泌醛固酮，導致水鈉潴留，體液容量擴增繼而引起血壓升高、腎素-血管緊張素系統受抑制、鉀分泌過多，嚴重者導致低鉀血癥。以往認為原醛的發病率占輕中度高血壓患者的1%，但近些年的研究表明原醛在高血壓患者中的比例超過10%［1-3］，而且，相對于同年齡、同性別以及血壓水平相當的原發性高血壓患者，原醛患者的心血管疾病發生率和死亡率均更高［4，5］，因此及早識別原醛對于早期治療和改善預后尤為重要［6］。

近年來發展的全自動化學發光免疫法（CLIA）可直接測定血漿腎素濃度，具有操作簡便、快速、無放射性污染的特點，已有研究表明醛固酮與腎素濃度的比值（ADRR）在鑒別原醛的效果上與RIA的醛固酮的濃度/腎素活性（ARR）相似［7，8］，并且此方法已收入內分泌學會臨床實踐指南［9］，但此方法目前并未在國內廣泛開展，本研究對此方法進行了較為全面的檢測方法學評價，以期為臨床推廣應用提供參考。

1 資料與方法

研究對象：選取2015-05至2015-08因高血壓原因待查在阜外醫院入院的患者40例，其中最終確診原醛患者7例，原醛診斷以臨床醫生依據病史、體征、臥立位醛固酮、腎素和ARR、鹽水負荷實驗、腎上腺靜脈采血等作出的綜合判斷為金標準。

入選北京地區健康受試者20例，年齡26～66歲，其中男性10例，女性10例，通過問卷調查方式將高血壓、心臟病、腎臟疾病等除外。

腎素和醛固酮檢測方法：CLIA采用意大利索靈公司全自動化學發光儀（Diasorin Liaison）檢測，其原理是將一個能識別被測物的特異性單克隆抗體包被在磁微粒（固相）上，另一個被測物特有的單克隆抗體結合在發光底物上，只有被測物分子兩側都存在抗體的結合物被保留，在催化劑作用下產生光信號，發光強度與被測物濃度成正比。本文采用索靈公司醛固酮、腎素濃度檢測試劑盒檢測血漿醛固酮濃度（ng/dl）和腎素濃度（μIU/ml），并由此濃度值計算ADRR。

RIA采用北京北方生物技術研究所有限公司檢測血漿腎素活性［ng/（ml·h）］和醛固酮濃度（ng/ ml），ARR=（醛固酮/腎素活性）×100。

標本采集和保存：由于臨床上可依據患者由臥位到立位所產生的腎素和醛固酮的變化來協助判斷原醛，因此本研究對每位受試者分別采集臥位和立位血進行檢測。臥位標本于平臥過夜采集，立位標本站立2 h后靜坐15 min后采集，收集于EDTA抗凝采血管，立即于室溫離心（1760 g）10 min后收集血漿，分裝保存于-80℃冰箱，檢測時于37℃水浴迅速復融后用于測定。

檢測性能評價：精密度驗證：依據臨床實驗室標準化協會（CLSI） EP15-A文件（User Demonstration of Performance for Precision and Accuracy，2001年），將高低2個濃度水平血漿混合樣本，分別重復檢測20次，計算批內均值與變異系數；將高低2個濃度水平血漿混合樣本分別每日檢測2批次，每批次各檢測2次，連續檢測5天，計算批間均值與變異系數。

準確性驗證：實驗的準確性通過回收率來驗證，將高濃度標本和低濃度標本按照1：2、1：4、1：8進行混合，各重復測定兩次，取測定平均值與期望值計算回收率。

線 性 范 圍 驗 證：依 據CLSI EP6-A文 件（Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedure，2003年），將接近線性范圍上限的高值混合樣本，用低值混合樣本進行稀釋制備出6個梯度樣本，每份樣本重復測定2次，計算平均值，以測定值為Y，理論值為X，使用統計軟件擬合一次、二次、三次方程，評估是否線性。

參考值范圍驗證：依據CLSI C28-A2文件（How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory，2000年），對生產廠家提供的參考值范圍進行驗證（醛固酮為3.0～35.3 ng/dl，腎素為4.4～46.1 μIU/ml，ADRR＜3.7（ng/dl）/（μIU/ml），選取健康受試者20例，采血選擇立位，對醛固酮和腎素濃度進行測定并計算ADRR值，應少于2人的測定值超過生產廠家提供的參考范圍。

臨床應用評價：高血壓原因待查患者40例（包括原醛和非原醛高血壓患者），進行篩查試驗，即測定臥、立位血漿腎素和醛固酮水平，以臨床診斷為金標準，評估CLIA區分原醛和非原醛患者的敏感性和特異性，并和RIA進行比較。CLIA原醛診斷標準：立位ADRR＞3.7（ng/dl）/（μIU/ml）；RIA原醛診斷標準：立位ARR＞30（ng/ml）/［ng/（ml·h）］。

統計學方法：采用SPSS 17.0進行統計學分析。正態分布計量資料以±s表示，采用獨立樣本t檢驗；率的比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

CLIA法精密度驗證（表1、2）：醛固酮濃度的批內和批間變異系數分別小于5%和10%，腎素濃度的批內和批間變異系數均小于5%，均在可接受范圍內。

表1 化學發光免疫法醛固酮濃度精密度驗證

表2 化學發光免疫法腎素濃度精密度驗證

CLIA法準確性驗證（表3）：醛固酮和腎素的平均回收率分別為102%和95%，在可接受范圍內。

表3 醛固酮和腎素濃度的回收率

CLIA法線性范圍驗證：一次線性方程醛固 酮 為 y=0.9959x-0.0156，r2=0.9995；腎 素 為y=0.9945x+2.0761，r2=0.9999。兩次多項式系數a的P＞0.05；三次多項式系數a和b的P＞0.05。顯示二次、三次多項式系數與“0”無明顯差異，說明醛固酮濃度在3～74 ng/dl范圍內、腎素濃度在0.99～330.00 μIU/ml范圍內呈線性。

CLIA法參考值范圍驗證：結果顯示腎素濃度男女性各有1例超過參考值范圍（4.4～46.1μIU/ml），分別為50.23 μIU/ml和50.97 μIU/ml，超出范圍的百分數為10%，在可接受范圍內。20例健康受試者醛固酮和ADRR值均在參考值范圍內，表明可采用此參考值范圍。

兩種醛固酮和腎素檢測方法診斷原醛的效能結果：CLIA的檢測特異性和敏感性分別為97.0%和85.7%，RIA的檢測特異性和敏感性分別為94.0% 和85.7% 。兩種方法的檢測敏感性相同，但CLIA的特異性略高于RIA。

3 討論

本研究結果顯示CLIA的精密度、準確性、線性范圍均符合臨床需要。對廠商提供的正常人參考范圍進行的驗證表明目前此參考值范圍可用于臨床。此外利用患者標本進行方法學比對，結果顯示CLIA與RIA對原醛的診斷能力相當。

自1981年Hiramatsu等［10］首次提出檢測腎素活性并計算ARR來篩查原醛后，此方法延用至今，目前臨床上仍以RIA測定的醛固酮和腎素活性為主，其中腎素活性是通過測定血管緊張素原轉換為血管緊張素Ⅰ的速率來間接測得，雖然這種方法在臨床使用多年，但一直存在較明顯的局限性：其一是檢測周期長，出報告時間至少需要3天；其二是檢測重復性差，檢測受多種體內和體外因素影響，結果無可比性。因此，ARR在臨床的使用面臨了較大的挑戰。2004年研究報道了全自動CLIA直接測定腎素濃度的方法［11］，這種方法幾乎克服了RIA測定腎素活性所有的不足，唯一的問題是腎素活性與腎素濃度的相關性以及利用腎素濃度計算所得的ADRR在篩查原醛的效果上是否與ARR相當，事實上，國外已經有許多研究表明這兩種方法之間具有良好的相關性［7，8，12，13］，甚至包括在卡托普利試驗中的相關性［14］，而在2008年的歐洲內分泌學會臨床實踐指南中也已納入腎素濃度的檢測方法［9］。但是國內則少有醫院對此方法進行評價并投入臨床使用，僅有中山大學附屬第一醫院賴鳳華等［15］和重慶醫科大學第一附屬醫院孫明芳等［16］分別報道了這兩種方法的比對和在原醛診斷中的篩查價值。與國內外其他研究者的結果一致，我們的研究通過較為全面的方法學評價，表明了CLIA測定腎素濃度和醛固酮的可用性和基于腎素濃度的ADRR用于篩查診斷原醛的可行性。

ARR用于篩查原醛的診斷界值尚無定論。主要是因為腎素檢測方法的不同而導致的診斷界值的差異，基于檢測腎素活性的RIA通常采用的診斷界值是30 （ng/ml）/［ng/（ml·h）］，而基于腎素濃度的CLIA的診斷界值則在不同的研究中提出不同的界值和單位，歐洲內分泌學會臨床實踐指南推薦的是立位ADRR大于3.7（ng/dl）/（μIU/ml）［9］，而Glinicki等［8］的研究則為立位ADRR大于30（pg/ml）/（pg/ml），孫明芳等［16］的研究所確定的診斷界值則為立位ADRR大于43.45 （pg /ml） /（μIU/ml），造成差異的原因一是腎素濃度單位的差異，二是研究人群本身不同。本研究中廠家所采用的ADRR單位是（ng/dl）/（μIU/ml），其診斷界值為3.7（ng/dl）/（μIU/ml） ，因為本研究的主要目的是評價CLIA的檢測性能，故本文并未建立本實驗室的ADRR診斷界值，而是用給定的診斷界值判斷檢測結果并與臨床診斷相比對，我們發現在篩查試驗中RIA和CLIA的敏感性均為85.7%，而特異性則分別94.0%和97.0% ，這雖然證明了CLIA可替代RIA，但也提示了3.7（ng/dl）/ （μIU/ml） 可能并不是最佳診斷界值，因為作為篩查試驗的敏感性略顯不足，這也是為什么指南中RIA的診斷界值會是20～40（ng/dl）/［ng（ml·h）］ 這樣一個范圍，而CLIA的最佳診斷界值則需要更多數據的積累。

本研究有其不足之處，一是對于正常參考值范圍，我們僅是對廠商提供的參考范圍進行了驗證，但實際上應該針對中國人群建立我們實驗室自己的參考值范圍，不過這部分工作我們實驗室已經在籌備進展中。另一個不足之處就是用于方法學比對的患者標本數量偏少，本研究是參照EP9-A2文件的最低樣本量40例所開展，我們將進一步擴大標本量對兩種方法進行更為完善的評價。

總之，本研究對CLIA檢測醛固酮和腎素濃度診斷原醛進行了較為全面的方法學評價，我們認為與RIA相比，CLIA操作簡單快速重復性好，沒有放射性污染，對于原醛的診斷效果與RIA相似，可以替代RIA用于原醛的篩查試驗。

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（編輯：常文靜）

Corresponding Author：CHEN Xi， Email：chenxifw@126.com

收稿日期：（2016-01-12）

作者單位：100037 北京市，中國醫學科學院 北京協和醫學院 國家心血管病中心 阜外醫院 臨床檢驗中心 （王芳、康金鎖、叢祥鳳、陳曦），心內科（鄒玉寶、蔣雄京）

作者簡介：王芳 助理研究員 博士 主要研究方向為心血管疾病生物標志物 Email：fray.163@163.com 通訊作者：陳曦 chenxifw@126.com

中圖分類號：R54

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）06-0606-04

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.06.020

Evaluation of Chemiluminescence Immunoassay for Detecting Blood Levels of Aldosterone and Renin With its Diagnostic Value of Primary Aldosteronism

WANG Fang， KANG Jin-suo， ZOU Yu-bao， JIANG Xiong-jing， CONG Xiang-feng， CHEN Xi.
Department of Laboratory Medicine， Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital， CAMS and PUMC， Beijing （100037）， China

Abstract