地中海貧血實驗室篩查指標評價

陳熙　肖克林　羅茗月　麥光興　夏勇

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地中海貧血實驗室篩查指標評價

陳熙肖克林★羅茗月麥光興夏勇

［摘要］目的探討多項實驗室指標用于篩查地中海貧血（簡稱地貧）基因攜帶者的臨床應用價值。方法選取在深圳市寶安區婦幼保健院體檢、婚檢和產檢的人員1 373例，對其均進行血常規血細胞分析、血紅蛋白成份分析和地貧基因診斷。以基因診斷為金標準，對已明確診斷的α?地貧組548例、β?地貧組248例、α?合并β?地貧組33例和非地貧組544例，進行紅細胞參數［紅細胞數量（red blood cell count，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HB）含量、紅細胞壓積（hematocrit，HCT）、平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、平均血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）和血紅蛋白A2（hemoglobin A2，HbA2）含量］比較；計算MCV、MCH和HbA23項血液學指標聯合篩查結果的靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值。結果地貧組與非地貧組比較，地貧組HB、HCT、MCV、MCH和MCHC均減低，差異均有統計學意義（P<0.05）。與非地貧組相比較，β地貧組HbA2值明顯升高（P<0.05）。MCV與MCH 2項平行聯合篩查地貧的靈敏度及特異度分別為94.0%和82.9%；MCV、MCH和HbA2?HPLC 3項平行聯合篩查地貧的靈敏度及特異度為97.7%和39.2%。結論HbA2定量分析是篩查β?地貧極有價值的實驗室指標，但對于篩查α?地貧敏感性較差，漏檢率高。MCV、MCH兩者平行聯合或與HbA2?HPLC三者平行聯合篩查有較高的檢測靈敏度，但特異度不甚理想。因此在進行地貧篩查時，需綜合分析實驗室各項指標，以降低漏診率。

［關鍵詞］地中海貧血；平均紅細胞體積；平均血紅蛋白含量；血紅蛋白

地中海貧血（簡稱地貧）是由于珠蛋白基因突變導致肽鏈表達失衡而產生的單基因常染色體隱性遺傳性貧血病［1］。根據生成減少的珠蛋白鏈種類將地貧分為α?、β?、δβ?和δ?型地貧等類型，其中α?和β?地貧較為常見。本病高發于地中海沿岸和東南亞各國，在我國多分布于廣東、廣西、海南、四川等省區［2］。該病危害大［3］，重型地貧患者絕大多數于兒童期死亡。目前通過實驗室方法對地貧進行篩查和產前基因診斷是杜絕重型地貧患兒出生的有效措施。地貧的常規實驗室篩查項目主要為血液學檢查內容，包括紅細胞參數、血紅蛋白分析等［4］。地貧基因診斷則是確診該病的金標準［5］，一般基于PCR、核酸雜交、基因芯片和DNA測序等技術。為合理選擇實驗室檢查項目和方法進行地貧篩查，本研究對篩查地貧的各項實驗室指標［紅細胞數量（red blood cell count，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HB）含量、紅細胞壓積（hematocrit，HCT）、平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemo?globin，MCH）、平均血紅蛋白濃度（mean corpuscu?lar hemoglobin concentration，MCHC）、血紅蛋白A2（hemoglobin A2，HbA2）含量］進行系統分析，評價其臨床應用價值。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取從2012年1月至2013年12月在深圳市寶安區婦幼保健院體檢、婚檢和產檢的人員1 373例，年齡17~48歲，平均年齡為26.9歲，所選研究對象均進行血細胞分析、血紅蛋白成份分析和地貧基因診斷。基因診斷確診地貧基因攜帶者829例，非地貧患者544例。

1.2儀器與試劑

Coulter LH750血細胞分析儀（Beckman，美國），VariantTMⅡ血紅蛋白分析儀（Bio?Rad，美國），Mastercycler5331梯度PCR儀（Eppendorf，德國），凝膠成像分析系統（UVI，英國），電泳儀（北京六一儀器廠DYC系列），雜交儀（UVP，美國），全血DNA快速提取試劑盒（深圳亞能生物技術有限公司），α?/β?地中海貧血基因檢測試劑盒（深圳亞能生物技術有限公司），電泳緩沖液：0.5×TBE（深圳亞能生物技術有限公司），瓊脂糖（solarbio，西班牙）。

1.3方法

1.3.1紅細胞參數檢測

采用全自動血細胞分析儀檢測紅細胞參數，嚴格執行實驗室質控檢測。設定成人MCV、MCH正常參考值范圍分別為80~95 fL和27~31 pg，取MCV<80 fL、MCH<27 pg為陽性截斷值。

1.3.2血紅蛋白分析

采用離子交換高效液相色譜（high perfor?mance liquid chromatography，HPLC）方法分離紅細胞中的血紅蛋白成份［6］，根據出峰時間（保留時間）和出峰面積大小來分析不同血紅蛋白的成份和含量。實驗操作和結果分析均按說明書進行。設定成人HbA2的正常參考值范圍為2.5%~3.5%，取HbA2<2.5%或HbA2>3.5%為陽性截斷值。

1.3.3地中海貧血基因診斷

首先通過柱式分離法提取全血DNA。再采用gap?PCR方法檢測中國人群中常見的3種缺失型α?地貧（??SEA、?α3.7與?α4.2），采用PCR?反向斑點雜交（PCR?reverse dot blot，PCR?RDB）技術檢測常見的3種突變型α?地貧（αcsα、αQsα、αwsα）和17種突變型β?地貧｛CD41?42（?TTCT），IVS?Ⅱ?654（C→T），?28（A→G），?29（A→G），?30（T→C），?32（C→A），CD17（A→T），CD31（?C），CD43（G→T），CD71?72（+A），βE（GAG→AAG），CD14?15（+G），CD27/28（+C），IVS?Ⅰ?1（G→A，G→T），IVS?Ⅰ?5 （G→C），CAP［CAP+1（A→C）/5’UTR；+43to+40（?AAAC）］，Int（ATG→AGG）｝。

1.4統計學處理

計量資料以x±s表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1地中海貧血基因攜帶率

選取的1 373例產檢、婚檢及健康體檢者中共檢出829例地貧基因攜帶者。其中單純α?地貧基因攜帶者548例，攜帶率為39.9%；β?地貧基因攜帶者248例，攜帶率為18.1%；α合并β地貧基因攜帶者33例，攜帶率為2.4%。

2.2地中海貧血基因突變類型

α?地貧基因突變類型包括??SEA、?α3.7、?α4.2、αcsα、αQsα、αwsα，其中??SEA型最為常見，占66.8%。β?地貧共檢出11種基因突變類型，其中CD41?42（?TTCT）和IVS?Ⅱ?654（C→T）為最常見的突變類型。

2.3血常規紅細胞參數比較

統計紅細胞6項參數：紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白含量（HB）、紅細胞壓積（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）、平均血紅蛋白含量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）。α?、β、α合并β地貧組的MCV、MCH、MCHC、HB、HCT與非地貧組比較均降低，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1　地貧患者與健康者紅細胞參數測定結果比較（x±s）Table 1　The erythrocyte parameters of thalassemia patients and normal subjects（x±s）

2.4HbA2測定結果

與非地貧組比較，β?地貧組和α合并β地貧組HbA2值明顯升高（P<0.05），α?地貧組HbA2輕度降低（P<0.05），見表2。

表2　非地貧組和地貧組HbA2結果比較（x±s）Table 2　HbA2of thalassemia patients and normal subjects（x±s）

2.5MCV、MCH、HbA2聯合實驗檢測

本研究采用MCV、MCH兩者平行聯合或與HbA2?HPLC三者平行聯合實驗來篩查地貧攜帶率，當三者平行聯合篩查時，靈敏度可達97.7%，但特異度較低，見表3、表4。

表3MCV、MCH、HbA2?HPLC平行聯合實驗篩查地貧陽性例數（n）Table 3　The positive cases of the parallel test for MCV，MCH，HbA2?HPLC on screening thalassemia（n）

表4MCV、MCH、HbA2?HPLC平行聯合實驗檢測地貧的評價指標（%）Table 4　The effectiveness of the parallel test for MCV，MCH，HbA2?HPLC on screening thalassemia（%）

3　討論

重型地貧患者需終生靠輸血和去鐵治療維持，因此通過選擇性引產是預防重型地貧患兒出生的有效對策［7］。深圳是個移民城市，城市人員來自不同地區，為做好地貧基因產前診斷和遺傳咨詢工作，首先需了解這一區域地貧基因的常見缺失和突變類型。在本研究所選受檢對象中，α?地貧攜帶率最高的為東南亞缺失型，這也是我國南方最主要缺失型［8］；CD41?42（?TTCT）和IVS?Ⅱ?654（C→T）為常見β?地貧基因突變類型，同廣東省其他地區報道的類似［9］；α合并β復合型地貧的攜帶率為2.4%，高于廣州報道的0.37%［10］，可能與選擇的人群不同有關。

目前，實驗室地貧篩查項目一般包括紅細胞參數檢測，紅細胞滲透脆性試驗、血紅蛋白組分分析和血清鐵代謝檢測等。為建立準確、快速地篩查模式，本研究系統評價實驗室各項地貧篩查指標，以簡化診斷策略。紅細胞參數檢測對發現貧血有重要意義，一般患者MCV<80 fL，MCH<27 pg提示其可能是患缺鐵性貧血或為地貧基因攜帶者，并且MCV和MCH的減低程度與地貧類型和貧血嚴重性相關［11］。MCV及MCH等紅細胞參數在地貧篩查中日益受到重視，已被國內外普遍應用于地貧篩查。本研究中地貧基因攜帶者和正常對照組的紅細胞參數各項指標有明顯差異，地貧組的MCV和MCH均降低（P<0.001），β?地貧組、α合并β復合型地貧組較α?地貧組降低更為明顯。但需要注意，缺鐵性貧血同樣可能造成小細胞低色素性貧血，MCV、MCH值也會降低，這會造成地貧篩查時假陽性增高，臨床中可以通過檢測血清鐵和鐵蛋白進行排除。

血紅蛋白組分分析是地貧篩查中重要檢查項目［12］。常用的血紅蛋白分析技術有瓊脂糖凝膠電泳、高效液相色譜法（HPLC）、毛細管電泳（capil?lary electrophoresis，CE）等。HPLC重復性好、操作簡便是定量檢測HbA2及HbF和分離鑒定異常血紅蛋白的優良方法［13］。HbA2是篩查地貧極有價值的指標，當HbA2大于3.5%提示攜帶β?地貧可能性大，而α?地貧的HbA2值一般小于2.5%。本研究中，β?地貧組HbA2值明顯高于非地貧組，靈敏度、特異度、準確率較高。α?地貧組HbA2值相對非地貧組輕度降低，且有30.5%的α?地貧基因攜帶者HbA2含量正常，因此HbA2定量分析用于α?地貧篩查時敏感性差，漏檢率高。此外，在研究中發現α合并β地貧組的HbA2值相對正常對照組顯著增高，篩查如果僅靠HbA2單項指標評估會造成漏診，實驗室人員不能因為HbA2值升高而忽視了β合并α的復合型地貧類型，需結合其他指標進行分析，避免漏診。

本研究中采用MCV、MCH兩者平行聯合或與HPLC三者平行聯合篩查地貧，可以降低單項檢測的假陰性率，提高檢測陽性病例的靈敏度，用于地貧篩查時漏診率低，但特異度相對較差，進一步確診需要做基因分析。基因診斷方法因地貧的不同類型而異。對于已知的地貧基因檢測，實驗室常用技術為gap?PCR、PCR?RDB、實時PCR熔解曲線分析等［14］。gap?PCR可以檢測缺失和重排，是診斷缺失型地貧的常規方法。PCR?RDB能同時檢測多個位點突變，多用作突變型地貧診斷。近年來實時PCR熔解曲線分析正逐漸受到人們的關注，其主要有熒光標記探針熔解曲線和高分辨熔解曲線2種分析技術，具有靈敏度高，特異性強等優點，適合臨床應用推廣。而DNA測序技術用來檢測未知地貧突變基因結果準確，但操作繁瑣，成本較高，可以選擇作為罕見病例確證的方法。

綜上所述，在進行地貧篩查時，需綜合分析實驗室各項指標聯合檢測的數據，以降低漏診率和假陽性率［15］。血常規紅細胞參數聯合血紅蛋白成分分析是目前最為簡單、經濟的地貧篩查方案，適用于各基層醫療單位；根據篩查結果再進一步行基因診斷則可有效地避免重型地中海貧血患兒出生，極大地提高社會人口質量。

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作者單位：深圳市寶安區婦幼保健院中心實驗室，廣東，深圳518133★通訊作者：肖克林，E?mail：lcxkl@163.com

Evaluation of laboratory index for screening thalassemia

CHEN Xi，XIAO Kelin★，LUO Mingyue，MAI Guangxing，XIA Yong
（Central Laboratory，Bao’an Maternal and Child Health Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518133）

［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the value of several laboratory indexes(RBC,HB,HCT,MCV, MCH,MCHC and HbA2)for screening thalassemia.Methods1 373 cases were recruited from Shenzhen Bao’an Maternity and Child Health Hospital,including 548 α?thalassemia,248 β?thalassemia,33 α?and β?combined thalassemia and 544 normal,all have been tested for routine blood erythrocyte parameters(red blood cell count,RBC;hemoglobin,HB;hematocrit,HCT;mean corpuscular volume,MCV;mean corpuscular hemo?globin,MCH;mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)and hemoglobin A2(HbA2)quantitative, a?and b?thalassemia associated genes.The sensitivity,specific,positive predictive value and negative predic?tive value of MCV,MCH and HbA2for screening thalassemia were calculated by using gene examination re?sults as the golden standard.ResultsIn comparison with normal subjects,RBC,HB,HCT,MCV,MCH and MCHC of thalassemia cases declined(P<0.05),HbA2of β?thalassemia increased significantly(P<0.05). The sensitivity and specificity of parallel test of MCV and MCH were 94.0%and 82.9%;The sensitivity and specificity of parallel test of MCV,MCH and HbA2?HPLC were 97.7%and 39.2%.ConclusionHbA2quan?titaty is a reliable index for screening β?thalassemia,but not good for screening α?thalassemia because of thelower sensitivity and high misdiagnosis risk.The parallel tests of MCV,MCH and HbA2?HPLC were of higher detection sensitivity,but specificity of that was not ideal.So the laboratory indexes of screening thalassemia should be analyzed comprehensively,in order to reduce the rate of misdiagnosis.

［KEY WORDS］Thalassemia;Mean corpuscular volume;Mean corpuscular hemoglobin;Hemoglobin