游離金雀異黃素和大豆苷元大鼠尿液排泄動(dòng)力學(xué)研究

鄒慧琴　劉亞蘭　　余夢杰　王海鵬　　王毓　　謝寶剛　張守華

?

游離金雀異黃素和大豆苷元大鼠尿液排泄動(dòng)力學(xué)研究

鄒慧琴1劉亞蘭1余夢杰1王海鵬1王毓1謝寶剛1張守華2★

［摘要］目的建立大鼠尿液中游離金雀異黃素（genistein，GT）和大豆苷元（daidzein，DD）同時(shí)定量的分析方法，獲得其口服后大鼠尿液排泄動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為大豆異黃酮生物利用度研究和評(píng)價(jià)提供新的方法。方法大鼠單次灌胃給予GT和DD混懸液（15.0 mg/kg），在給藥后不同時(shí)間段收集尿液，尿液經(jīng)冷凍干燥后，加1.0 mL甲醇溶解提取目標(biāo)化合物。采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定游離GT和大DD的濃度，采用Krommasil C18色譜柱，以甲醇?水（52∶48）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min柱溫為30℃，檢測波長254 nm。結(jié)果建立的高效液相色譜法?紫外法（HPLC?UV）方法專屬性強(qiáng)，在0.5~10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，良好的精密度及較高的準(zhǔn)確度。尿液排泄動(dòng)力學(xué)曲線圖上第4.5 h和13.5 h別顯示小腸和肝腸循環(huán)2個(gè)吸收峰，游離GT和DD清除半衰期分別為（7.5±0.59）h和（8.5±1.2）h，72 h尿液累積量分別為（45.2±7.2）μg和（56.1±12.2）μg。結(jié)論所建立的方法可靠，簡便快速，可用于比較和評(píng)價(jià)大豆異黃酮類制劑的口服吸收生物利用度和代謝動(dòng)力學(xué)研究。

［關(guān)鍵詞］游離金雀異黃素和大豆苷元；高效液相色譜；尿液排泄動(dòng)力學(xué)；生物利用度

大豆異黃酮是一種重要的植物雌激素，它能通過與雌激素受體（estrogen receptor，ER）競爭性地結(jié)合從而干擾雌激素功能，發(fā)揮其生物學(xué)作用［1-2］。金雀異黃素（genistein，GT）和大豆苷元（daidzein，DD）是大豆異黃酮的主要活性成分，具有輕度雌激素樣作用，無明顯副作用，是一種安全的天然植物雌激素。近年來，許多研究表明，這2種化合物具有抗氧化、抗癌、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、預(yù)防心血管疾病、改善婦女更年期障礙、抗衰老等諸多生理功能［3?6］。歐洲一個(gè)大型流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在男性血液中，擁有更高濃度GT的人患前列腺癌的幾率更小［7］。目前國外各種大豆異黃酮的醫(yī)藥制品和保健食品正在積極開發(fā)，并已有相關(guān)品種上市銷售。

在體內(nèi)，GT和DD發(fā)揮其雌激素樣功能的物質(zhì)基礎(chǔ)可能其游離形式［8?9］，然而，血液中GT和DD主要以他們的代謝物如葡萄糖醛酸及硫酸酯代謝物存在，其游離形式不足總量的5%［1，10］。因此，以血液為樣品的藥代動(dòng)力學(xué)研究大多是測定血中總的GT和DD含量。迄今為止，國內(nèi)外關(guān)于GT和（或）DD在大鼠或人體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究較多，但關(guān)注體內(nèi)游離GT和DD排泄動(dòng)力學(xué)方面的研究很少。鑒于此，本文建立樣品預(yù)處理簡單、重復(fù)性好的對(duì)大鼠尿液中游離GT和DD進(jìn)行同時(shí)定量的HPLC?UV分析方法，在此基礎(chǔ)上，獲得大鼠口服GT和DD后的尿液排泄動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為大豆異黃酮各種制劑口服吸收生物利用度研究和評(píng)價(jià)提供新的方法。

1　材料與方法

1.1儀器與試藥

高效液相色譜儀（島津10A?VP系統(tǒng)，配備雙波長紫外檢測器，日本島津公司）；冷凍干燥機(jī)（LGD?10D，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）；CQ?250型超聲波清洗儀（上海中船七院七二六所）；Sartorious BP211D型十萬分之一電子天平（德國沙多利斯公司）。GT和DD購自上海融禾生物科技發(fā)展有限公司（純度大于98%，GT和DD批號(hào)分別為：20140708和20140904）；另取大約5 g GT和DD 80℃真空干燥至恒重后作為對(duì)照品使用。色譜純甲醇（上海陸都有機(jī)化學(xué)試劑有限公司），水為自制三重蒸餾水。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague?Dawley（SD）大鼠由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證書：醫(yī)動(dòng)字第021?9602號(hào)，不含大豆成分飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程自由進(jìn)食和水。

1.3HPLC色譜分析條件

采用Krommasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，迪馬科技有限公司）色譜柱。以甲醇?水（52：48，v/v）為流動(dòng)相，等度洗脫。流速1.0 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣20 μL，檢測波長254 nm。

1.4給藥方案

8只SD大鼠，體重(200±20)g，不銹鋼代謝籠單獨(dú)飼養(yǎng)，每天光照12 h，室溫（22~24℃），室內(nèi)相對(duì)濕度30%~70%。適應(yīng)喂養(yǎng)3 d后，第4天上隨機(jī)收集2只大鼠21：00~9：00夜間12 h尿液，作為空白尿樣。上述收集尿樣馬上于5 000 rpm離心10 min 于-20℃冷凍保存。分別稱取GT和DD約50.0 mg，用0.2%CMC?Na溶液配制濃度為3.0 mg/mL的混懸溶液，第5天大鼠灌胃給藥，第3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h后分別收集其尿液，5 000 rpm離心，取上清置于-20℃冰箱備用。

1.5尿液樣品的處理

所收集的尿液樣品自然解凍后，間隔3 h樣品（大約2~4 mL）全部用來冷凍干燥；間隔12 h樣品由于量較大，準(zhǔn)確測定體積后取4.0 mL進(jìn)行冷凍干燥。凍干粉末每管加1.0 mL甲醇，漩渦振蕩、超聲約2 min，于10℃14 000 rpm離心10 min，取0.5 mL 于1.5 mL離心管中，再加0.5 mL蒸餾水，HPLC進(jìn)樣20 μL測定游離GT和DD的含量。

1.6對(duì)照品溶液的配制

一定濃度的GT和DD對(duì)照品溶液用水稀釋使其終濃度為100.0 μg/mL和102.5 μg/mL的工作液。分別取5、10、20、40、80、100 μL到不同的EP管中，編號(hào)。各管分別加入3.0 mL空白尿液，凍干，按樣品處理方法同樣提取后分別進(jìn)樣色譜分析，以目標(biāo)色譜峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品濃度作圖，得到尿樣工作曲線。

2　結(jié)果

2.1色譜條件的優(yōu)化和方法的專屬性

本實(shí)驗(yàn)色譜分離條件的優(yōu)化主要考察流動(dòng)相的組成和檢測波長2個(gè)因素對(duì)樣品分離效果的影響。考察了3個(gè)pH值（2.5，4.0，6.0）的10 mM乙酸銨溶液以及蒸餾水作為水相，甲醇或乙腈作為有機(jī)相的流動(dòng)相對(duì)尿樣提取物中GT和DD分離。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)的幾種流動(dòng)相對(duì)2種化合物均能達(dá)到基線分離，且色譜峰型對(duì)稱。考慮到實(shí)驗(yàn)成本和流動(dòng)相配制的方便，本實(shí)驗(yàn)選用甲醇?水溶液為流動(dòng)相。鑒于尿樣提取物樣品較為復(fù)雜，8 min前有一定的干擾，流動(dòng)相定為52%的甲醇，此時(shí)2種化合物出峰時(shí)間在8.5 min和12.0 min左右。鑒于GT和DD的最大吸收波長分別為260 nm和248 nm，考慮到需同時(shí)在尿液中檢測GT和DD，故選擇檢測波長為254 nm定量，以獲得較高的檢測靈敏度。

分別取空白尿液、空白尿液加入GT和DD對(duì)照品，以及大鼠給予GT和DD后所收集尿液，按建立的尿樣處理方法和HPLC方法操作和進(jìn)樣，所得的色譜圖見圖1。從圖上可看出，在建立的HPLC條件下及樣品提取處理?xiàng)l件下，樣品中的內(nèi)源性成分及檢測物質(zhì)代謝物等對(duì)目標(biāo)成分的含量測定沒有干擾，說明該方法具有良好的專屬性。

2.2工作曲線的建立

按照上述尿液樣品處理方法，配制含有GT和DD系列濃度的尿液對(duì)照品溶液，分別進(jìn)行HPLC分析。以GT和DD的峰面積對(duì)應(yīng)其濃度進(jìn)行線性回歸，得到對(duì)尿液樣品中GT和DD定量的工作曲線。GT和DD的回歸方程分別為：A=91 344C+9 168.2和A= 76 402C+16 879（其中A為峰面積，C為濃度），2種化合物在0.5~10.0μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明他們的濃度和色譜峰面積信號(hào)具有良好的相關(guān)性，滿足定量的要求。根據(jù)色譜信號(hào)信噪比大于3∶1的最低濃度為檢測限，10∶1為定量限的方法計(jì)算。逐步稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液，結(jié)果顯示GT和DD 2種化合物的檢測限分別為0.014 μg/mL和0.030 μg/mL，定量限分別為0.06μg/mL和0.07μg/mL。

2.3精密度

分別以空白尿液加終濃度為10.4 μg/mL的GT 和12.2 μg/mL的DD對(duì)照品溶液在同一天（及第2天）重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算相關(guān)色譜峰的峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差表示日內(nèi)（日間）精密度。GT精密度為日內(nèi)2.12%，日間精密度為2.74%。DD日內(nèi)精密度為1.88%，日間精密度為3.3%。

2.4穩(wěn)定性

從以上日間精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，2種化合物在24 h內(nèi)濃度變化相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative stan?dard deviation，R.S.D.）。小于5.0%，說明樣品比較穩(wěn)定。上述樣品4℃放置一個(gè)月后按同樣方法測定，以原來的標(biāo)準(zhǔn)溶液（4℃保存）建立新的工作曲線，計(jì)算其濃度分別為9.9 μg/mL和11.6 μg/mL，變化R.S.D.仍小于5.0%，表明實(shí)驗(yàn)樣品具有良好的短和長期穩(wěn)定性。

2.5樣品提取回收率及方法加樣回收率

把含19.6 μg/mL的GT和20.4 μg/mL的DD對(duì)照品溶液尿液凍干粉用甲醇一次提取后，不溶物離心，沉淀再用0.5 mL甲醇溶解，溶解物進(jìn)行HPLC分析，此時(shí)檢測不到目標(biāo)化合物的存在，說明加入1.0 mL甲醇一次提取就可以基本完全提取目標(biāo)化合物。

按上述建立的方法，分別測定已知GT和DD含量的樣品，得到色譜圖，以及該樣品加一定量對(duì)照品（1.0 μg/mL、3.0 μg/mL、6.0 μg/mL 3個(gè)濃度）的色譜圖，以工作曲線計(jì)算相應(yīng)的濃度，得到加樣回收率的數(shù)據(jù)。GT和DD樣品加樣回收率分別分別（100.6±5.8）%（n=3）和（102.6±4.5）%（n=3）。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，應(yīng)用HPLC?UV方法在尿樣中同時(shí)定量GT和DD專屬性強(qiáng)，在一定的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，良好的精密度及較高的準(zhǔn)確度。

2.6尿液游離GT和DD排泄動(dòng)力學(xué)

圖2是單位時(shí)間藥物排泄量（Du/dt）對(duì)時(shí)間作圖，從該圖明顯可以看出，GT和DD在給藥后4.5 h、13.5 h 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)一大一小2個(gè)吸收峰。異黃酮藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明在給藥后2 h及7 h左右，血液中出現(xiàn)2個(gè)吸收峰［10］，分別代表小腸和肝腸循環(huán)吸收。由于腎排泄的滯后性，因此在排泄動(dòng)力學(xué)曲線圖上給藥后第4.5 h（3~6 h中點(diǎn)）、13.5 h（12~15 h中點(diǎn)）2個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)2個(gè)峰，表明用尿液排泄動(dòng)力學(xué)方法與血液藥代動(dòng)力學(xué)方法具有很好的相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)以單位時(shí)間藥物排泄量（LogDu/dt）與時(shí)間作圖，對(duì)消除相線性回歸，求得直線斜率K，以T1/2＝0.693/K計(jì)算GT和大豆苷元在體內(nèi)的消除半衰期，相應(yīng)的尿液排泄動(dòng)力學(xué)參數(shù)列于表1。尿液72小時(shí)累積游離GT和DD分別為（45.2±7.2）μg和（56.1±12.2）μg。

表1　口服金雀異黃素和大豆苷元尿樣排泄動(dòng)力學(xué)參數(shù)（mean±S.E.，n=6?8）Table 1　The urinary pharmacokinetic parameters of genistein and daidzein after their oral administration（mean±S.E.，n=6?8）

3　討論

GT和DD體內(nèi)外檢測方法文獻(xiàn)報(bào)道較多，經(jīng)過萃取、酸化等前處理過程，Uif?lean等［11］以0.1%乙酸和乙腈為流動(dòng)性，利用HPLC?UV方法同時(shí)檢測了大豆保健品中GT、DD和大豆黃素，線性范圍為5.0~80 μg/mL。Magiera［12］以0.05%三氟醋酸和乙腈為流動(dòng)相，利用超高效液相色譜UHPLC?UV技術(shù)同時(shí)在中草藥保健品中同時(shí)檢測了GT、DD及其他14種化合物。GT和DD檢測限為0.05 μg/ mL。本文利用冷凍干燥的方法先處理尿液樣品，然后直接用甲醇提取，這樣可以保證有效提取GT 和DD的基礎(chǔ)上消除尿液中蛋白的影響，樣品用水適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)樣；另外HPLC?UV方分離GT 和DD等化合物，文獻(xiàn)大多采用較為復(fù)雜的流動(dòng)相，流動(dòng)相中如果含有三氟醋酸、三乙胺等化合物在HPLC過程中可能影響基線的穩(wěn)定、提高方法的檢測限。而對(duì)于生物樣品的分析來說，降低方法的檢測限是非常有必要的，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，直接用水和乙腈體系就能很好的在尿液樣品中分離這2種代謝物，該方法對(duì)GT和DD 2種化合物的檢測限分別為0.014 μg/mL和0.030 μg/mL。當(dāng)然，提高方法靈敏度的另外一種方法就是采用質(zhì)譜檢測器，如經(jīng)酶解、固相萃取等前處理過程，利用HPLC?MS技術(shù)［13］，包括GT和DD在內(nèi)的13種植物雌激素可以同時(shí)在人體血液和尿液中定量，尿中GT和DD檢測限小于1.0 ng/mL，具于MS的檢測技術(shù)需要貴重的儀器，樣品前處理復(fù)雜，分析成本高等缺點(diǎn)。經(jīng)方法學(xué)確證，本文建立的在尿樣中同時(shí)定量GT和DD的HPLC?UV方法，樣品前處理簡單、專屬性強(qiáng)、檢測限彽，在0.5~10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，良好的精密度及較高的準(zhǔn)確度，適應(yīng)于含GT和DD制劑大鼠的排泄動(dòng)力學(xué)研究。

人體口服大豆異黃酮后，血液中主要是GT和DD的葡萄糖醛酸及硫酸酯代謝物，其游離形式不足總量的5%［1，10］，含量極低，一般低于HPLC?UV方法的檢測限。因此，以血液為樣品的藥代動(dòng)力學(xué)研究大部分得先酶解，然后測定血中總的GT和DD含量，獲得GT和DD的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。然而，許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果［8，9，14］表明，GT和DD在體內(nèi)發(fā)揮其雌激素樣功能的物質(zhì)基礎(chǔ)是其游離形式，因此獲得游離GT和DD的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可能更有利于不同制劑的評(píng)價(jià)。鑒于GT和DD為小分子化合物，且主要由腎臟排泄，其尿中的含量與體內(nèi)血中的濃度具有一定的相關(guān)性［5］，因此本文建立了游離GT和DD在大鼠尿液中的HPLC?UV檢測方法，并獲得他們的排泄動(dòng)力學(xué)參數(shù)。本文結(jié)果顯示，口服GT和DD尿液清除半衰期為8 h左右，大鼠單次給予GT和DD后尿樣中游離GT和DD的變化滿足單室一級(jí)排泄動(dòng)力學(xué)模型，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［10，14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單次口服給予大鼠GT 和DD混懸劑（15.0 mg/kg），其尿液72 h累積游離GT和DD分別為（45.2±7.2）μg和（56.1±12.2）μg。由于尿液累積排泄總量與血漿藥物濃度—時(shí)間曲線下面積（AUC）成正相關(guān)，因此可用尿液中累積異黃酮量評(píng)價(jià)不同的異黃酮制劑的生物利用度。

總之，異黃酮的口服吸收生物利用度與其預(yù)防和治療疾病的藥理作用作用密切相關(guān)，到目前為止，以尿液為樣品的游離GT和DD排泄動(dòng)力學(xué)研究的報(bào)道很少。因此，本文建立了操作簡單、重復(fù)性好的對(duì)大鼠尿液中游離GT和DD進(jìn)行同時(shí)定量的HPLC?UV分析方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法專屬性強(qiáng)，在一定的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，良好的精密度及較高的準(zhǔn)確度。本文研究結(jié)果顯示基于尿液排泄動(dòng)力學(xué)的分析方法可用于比較和評(píng)價(jià)大豆異黃酮類制劑的口服吸收生物利用度；亦可用于大豆異黃酮在中國居民的體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)研究，為進(jìn)行慢性病治療、預(yù)防提供直接的理論數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］Ganai AA，F(xiàn)arooqi H.Bioactivity of genistein：A re?view of in vitro and in vivo studies［J］.Biomed Phar?macother，2015，76：30-38.

［2］Polkowski K，Mazurek AP.Biological properties of ge?nistein.A review of in vitro and in vivo data［J］.Acta Pol Pharm，2000，57（2）：135-155.

［3］Taylor CK，Levy RM，Elliott JC，et al.The effect of genistein aglycone on cancer and cancer risk：a review of in vitro，preclinical，and clinical studies［J］.Nutr Rev，2009，67（7）：398-415.

［4］Russo M，Russo GL，Daglia M，et al.Understanding genistein in cancer：the“good”and the“bad”effects：a review［J］.Food Chem，2016，196：589-600.

［5］Levis S，Strickman-Stein N，Ganjei?Azar P，et al.Soy isoflavones in the prevention of menopausal bone loss and menopausal symptoms：a randomized，doubleblind trial［J］.Arch Intern Med，2011，171（15）：1363-1369.

［6］Kim SH，Kim CW，Jeon SY，et al.Chemopreventive and chemotherapeutic effects of genistein，a soy isofla?vone，upon cancer development and progression in pre?clinical animal models［J］.Lab Anim Res，2014，30 （4）：143-150.

［7］Travis RC，Spencer EA，Allen NE，et al.Plasma phyto ?oestrogens and prostate cancer in the European Pro?spective Investigation into Cancer and Nutrition［J］.Br J Cancer，2009，100（11）：1817-1823.

［8］Spagnuolo C，Russo GL，Orhan IE，et al.Genistein and cancer：current status，challenges，and future di?rections［J］.Adv Nutr，2015，6（4）：408-419.

［9］Suthar AC，Banavalikar MM，and Biyani MK.Pharma?cological activities of genistein，an isoflavone from soy （Glycine max）：part II—anti?cholesterol activity，ef?fects on osteoporosis&menopausal symptoms［J］.In?dian J Exp Biol，2001，39（6）：520-525.

［10］Kwon SH，Kang MJ，Huh JS，et al.Comparison of oral bioavailability of genistein and genistin in rats［J］. Int J Pharm，2007，337（1-2）：148-154.

［11］Uifalean A，F(xiàn)arcas A，Ilies M，et al.Assessment of isoflavone aglycones variability in soy food supple?ments using a validated HPLC?UV method［J］.Clujul Med，2015，88（3）：373-380.

［12］Magiera S，Baranowska I，Lautenszleger A.UHPLC?UV method for the determination of flavonoids in di?etary supplements and for evaluation of their antioxi?dant activities［J］.J Pharm Biomed Anal，2015，102：468-475.

［13］Wyns C，Bolca S，de Keukeleire D，et al.Develop?ment of a high?throughput LC/APCI?MS method for the determination of thirteen phytoestrogens including gut microbial metabolites in human urine and serum［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2010，878（13-14）：949-956.

［14］Coldham NG，Sauer MJ.Pharmacokinetics of［（14）C］Genistein in the rat：gender?related differences，poten?tial mechanisms of biological action，and implications for human health［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2000，164（2）：206-215.

［15］Pons DG，Nadal?Serrano M，Torrens?Mas M，et al. The phytoestrogen genistein affects breast cancer cells treatment depending on the ERalpha/ERbeta ratio［J］.J Cell Biochem，2016，117（1）：218-229.

2.江西省兒童醫(yī)院普外科，江西，南昌330006★通訊作者：張守華，E?mail：zshouhua416@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81560631）

作者單位：1.南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西，南昌330006

Investigation of urinary pharmacokinetics of free genistein and daidzein in rats

ZOU Huiqin1，LIU Yalan1，YU Mengjie1，WANG Haipeng1，WANG Yu1，XIE Baogang1，ZHANG Shouhua2★
（1.School of Pharmaceutical Science，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi，China，330006；2.Department of General Surgery，Jiangxi Children’s Hospital，Nanchang，Jiangxi，China，330006）

［ABSTRACT］ObjectiveTo offer an alternative approach to evaluate the bioavailability of isoflavone by urinary excretion,establishing an HPLC method for the determination of free genistein and daidzein in rat urine and obtaining the parameters of urinary pharmacokinetics after their oral administration.MethodThe rats were orally administered with a single dose of genistein and daidzein（15 mg/kg）.Urine samples were collected from different time periods.The samples were lyophilized and then extracted ultrasonically by 1.0 mL methanol.HPLC analysis was performed by a reversed?phase HPLC column(Kromasil 100A,C18).The elution conditions for HPLC were methanol and water at the ratio of 52%（v/v）for isocratic elution,the column was maintained at 40℃,flow rate was 1.0 mL/min,and detection was set to 254.0 nm.ResultsAn excellent liner relationship was obtained by developed HPLC?UV method in the range of 0.5~10.0 μg/mL with high specificity, good precision and high accuracy.A plot of urinary isoflavone concentration versus time suggests that there were two peaks at 4.5 h and 13.5 h related to absorption in intestine and enterohepatic circulation.The half?time in urine was found to be(7.5±0.59)h and(8.5±1.2)h for genistein and daidzein respectively.The cumulative excretions of genistein and daidzein for 72 h were(45.2±7.2)μg and(56.1±12.2)μg,respectively.ConclusionThe method is reliable,simple,rapid and suitable for comparison and evaluation of oral bioavailability of isoflavone pharmaceutics as well as pharmacokinetic study.

［KEY WORDS］Free geinistein and daidzein;High performance liquid chromatography(HPLC); Urinary pharmacokinetics;Oral bioavailability