下一代測序技術(shù)的臨床應(yīng)用規(guī)范化問題
——參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

姜烈君　陸曉旭　　黃華藝，2★

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下一代測序技術(shù)的臨床應(yīng)用規(guī)范化問題
——參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

姜烈君1陸曉旭1黃華藝1，2★

［摘要］下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)已經(jīng)在臨床實驗室中得到應(yīng)用。該技術(shù)的發(fā)展以及檢測規(guī)模和應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，使基因檢測成本大大降低。NGS技術(shù)在臨床上的應(yīng)用在不斷地擴(kuò)大，如疾病靶向基因組套檢測、個體外顯子組或全基因組分析等。同時，NGS技術(shù)也進(jìn)一步改善了治療決策和對某疾病高危人群的預(yù)測。然而，NGS技術(shù)的發(fā)展也充滿了挑戰(zhàn)性，包括測序平臺和技術(shù)更新帶來的選擇困惑、測序結(jié)果的臨床驗證的不一致性問題等。為了幫助臨床實驗室更好地了解NGS技術(shù)、解決臨床驗證和正確選擇NGS測序平臺和方法，以及持續(xù)監(jiān)控NGS并保證高質(zhì)量的測序結(jié)果及其臨床解釋，本文結(jié)合美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）關(guān)于NGS技術(shù)在臨床上的應(yīng)用的專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和指南進(jìn)行歸納和討論，供我國分子診斷工作者制定國內(nèi)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)時參考。

［關(guān)鍵詞］美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會；下一代測序；疾病靶向的基因組套測序；外顯子組測序；全基因組測序

下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)是一種利用克隆擴(kuò)增或單分子模板技術(shù)進(jìn)行的大規(guī)模平行測序。NGS技術(shù)發(fā)展很快，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。NGS技術(shù)具有高通量和低單堿基成本的特點(diǎn)，但至今為止，該技術(shù)用于臨床檢測仍存在許多問題。比如，測序流程的標(biāo)準(zhǔn)化、測序平臺和技術(shù)原理不同使用戶在選擇上產(chǎn)生困擾、測序結(jié)果中數(shù)據(jù)分析的差異性以及結(jié)果與臨床的不一致性問題等。為此，本文結(jié)合美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會（American College of Medical Ge?netics and Genomics，ACMG）關(guān)于NGS技術(shù)的專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和指南進(jìn)行歸納和討論，供我國分子診斷工作者參考。

1　NGS分析概況

1.1NGS的3種分析水平

NGS技術(shù)按復(fù)雜度從低到高分為疾病靶向的基因檢測組套、外顯子測序（exome sequencing，ES）和基因組測序（genome sequencing，GS）3種。疾病靶向基因檢測組套用于檢測已知的疾病相關(guān)基因，它只對與某疾病相關(guān)的基因進(jìn)行測序，因此分析的靈敏度和特異性較高。在設(shè)備選擇方面，小型的臺式測序儀即可滿足此類檢測的要求，其所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量也較小，對數(shù)據(jù)存儲需求也不高。ES是一種檢測基因組中所有編碼區(qū)域的測序方法，該方法主要用于檢測已知疾病相關(guān)基因突變或發(fā)現(xiàn)新型致病基因。ES的測序能力和成本介于疾病靶向基因組套和GS之間，分析靈敏度低于大多數(shù)疾病靶向基因組套測序，分析的特異性也可能隨測序效率的減弱而相應(yīng)地降低，因此需要進(jìn)行Sanger測序確認(rèn)以排除假陽性突變信號。GS是全基因組測序，覆蓋編碼和非編碼區(qū)域，其優(yōu)點(diǎn)是預(yù)測序樣品制備簡單，不需要靶區(qū)域的PCR或雜交富集步驟。由于GS在非編碼變異體的解釋上不理想，所以通常先對編碼區(qū)進(jìn)行分析。如果未發(fā)現(xiàn)致病突變，那么可對數(shù)據(jù)進(jìn)行重新分析尋找非編碼區(qū)域的調(diào)節(jié)區(qū)域是否有變異。另外，GS分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)龐大，數(shù)據(jù)分析費(fèi)時，結(jié)果差異大，目前廣泛應(yīng)用于臨床尚不成熟。

1.2NGS的操作流程

包括3個主要步驟：樣品制備、測序和數(shù)據(jù)分析。樣品制備包括患者樣本的采集處理、DNA提取、文庫構(gòu)建、生物分子標(biāo)簽（barcode）、目的區(qū)域/基因捕獲富集、連接和擴(kuò)增等；測序步驟即把制備好的標(biāo)本上機(jī)測序；數(shù)據(jù)分析即對測序完成后所產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)通過專門檢測DNA變異的計算機(jī)流水線進(jìn)行分析處理，這種數(shù)據(jù)分析的主要流程包括堿基識別、讀取對齊、變異識別和變異注釋。

2　開展測序工作應(yīng)考慮的因素

實驗室開發(fā)NGS檢測分析的影響因素主要有：測序內(nèi)容、測序平臺和方法的選擇、數(shù)據(jù)分析工具的選擇、變異體過濾、同源區(qū)域測序及變異文件格式等，這些是開展測序工作前必須考慮的重要因素。

2.1測序內(nèi)容

在進(jìn)行NGS時，選擇與疾病高度相關(guān)的靶向基因組套來開展，即這些組套已經(jīng)有充足的科學(xué)證據(jù)證明其與該疾病的相關(guān)性。如果某靶向組套包含多重表型的基因，那么實驗室應(yīng)該向臨床醫(yī)生提供亞組套檢測來達(dá)到進(jìn)一步的針對性和減少實驗分析的工作量。一般來說，分析的區(qū)域越大，所得的與臨床表型相關(guān)的變異體數(shù)量也越多，數(shù)據(jù)分析的工作量也越大。

2.2測序平臺和方法的選擇

選擇測序平臺時，實驗室須仔細(xì)考慮測序區(qū)域的大小、需要的覆蓋范圍、預(yù)計的樣本量、運(yùn)行時間要求以及成本等來決定購買儀器的標(biāo)準(zhǔn)；也要根據(jù)要檢測的變異體數(shù)量和規(guī)模來選擇檢測平臺；測序模式有單向測序和雙向測序，雙向測序能使讀長更明晰，尤其對重復(fù)區(qū)域堿基數(shù)據(jù)的讀取十分必要。

2.3數(shù)據(jù)分析工具

每個NGS檢測平臺均安裝特定的堿基識別運(yùn)算公式軟件，一般用Phred樣評分評估堿基識別的正確性。對于疾病靶向檢測和ES，建議以參考基因組進(jìn)行全長校準(zhǔn)，以減少檢測組套以外的錯誤測序信息產(chǎn)生，同時增加測序覆蓋度來提高變異體識別的準(zhǔn)確度；對于GS，序列比對后再進(jìn)行局部比對有助于發(fā)現(xiàn)插入或缺失突變信息。

2.4變異體過濾

實驗室要設(shè)定變異體篩查方法，排除常見的良性變異，識別罕見疾病的分子。對于疾病靶向組套的NGS，實驗室需要建立自動分類工具，從罕見高外顯率變異體中過濾掉常見的良性變異。可用參考使用的數(shù)據(jù)庫工具包括dbSNP、NHLBI外顯子組測序項目和1000基因組項目的自動分類。而在ES或GS分析中，為識別罕見疾病的分子可采用適當(dāng)?shù)募彝コ蓡T作參照。同時實驗室必須把握好過度排除與過低排除的度，過度排除導(dǎo)致無意中排除掉致病突變，過低排除導(dǎo)致需分析過多的突變體，增加工作量。實驗室可循序漸進(jìn)，首先確定明確和明顯的病因，必要時可以重設(shè)篩選標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)大搜索突變基因的范圍。

2.5同源區(qū)域測序

同源序列如假基因?qū)Χ套x測序法有干擾。當(dāng)讀取的序列被不正確地與同源區(qū)域?qū)R時，NGS序列讀取的有限長度可能會導(dǎo)致假陽性變異應(yīng)答；但當(dāng)含突變的讀取與同源位點(diǎn)對齊時也可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，需找到在已知同源區(qū)域內(nèi)能檢測致病變異的方法，如用整體定位后再進(jìn)行局部定位或配對末端測序的方法。實際上，在某些情況下可用Sanger測序法及其特異的互補(bǔ)引物配對來確認(rèn)變異體所在區(qū)域。因此，實驗室必須具備豐富的NGS技術(shù)相關(guān)經(jīng)驗，充分意識到所用技術(shù)的局限性，必要時使用同類技術(shù)對所有疾病靶向或診斷性檢測結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。Sanger測序法是最常使用的確認(rèn)性檢測方法。

2.6文件格式

NGS檢測產(chǎn)物應(yīng)遵守常用的格式（如.bam文件代表信號對合，.fastq文件記錄序列信息與堿基質(zhì)量），所采用的數(shù)據(jù)格式要易于轉(zhuǎn)換到標(biāo)準(zhǔn)格式。目前標(biāo)準(zhǔn)格式?變異檢出格式（.vcf）已被1000基因組項目使用。

3　NGS的運(yùn)行校驗

NGS檢測的設(shè)備和試劑應(yīng)有合法的產(chǎn)品注冊證，其相關(guān)商品化產(chǎn)品需經(jīng)臨床實驗室驗證后才能成為診斷工具，其它未獲批準(zhǔn)的應(yīng)注明“僅用于探索性”、“僅用于研究”或“專一性分析試劑”；被視為實驗室自行開發(fā)的項目，需要進(jìn)行一系列完整的批準(zhǔn)程序。

3.1測試驗證和優(yōu)化

驗證的內(nèi)容包括樣品制備、測序平臺和數(shù)據(jù)分析方法等。測試流程選定后，應(yīng)進(jìn)行反復(fù)操作直到所有的測定條件以及分析設(shè)置達(dá)到最優(yōu)化為止；實驗室應(yīng)通過分析各種已知序列的變異體數(shù)據(jù)（例如：SNPs、小的插入/缺失、大的拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異）建立變異體識別操作規(guī)程。值得說明的是，使用合成的突變體有助于創(chuàng)建大批量試驗數(shù)據(jù)，可用于不同測序平臺的比較和優(yōu)化、設(shè)置各平臺閾值，因此，各實驗室要建立測試的標(biāo)準(zhǔn)操作文件并嚴(yán)格執(zhí)行。另外，優(yōu)化過程應(yīng)包含臨床上所有的樣本類型（例如：全血、唾液、福爾馬林固定的石蠟包埋組織）。

實驗室應(yīng)利用Sanger數(shù)據(jù)庫中存在的具有特征性的參考樣品來確定NGS的有效性，這些樣品不需包含特異的病理性突變，最好是可再生資源，用于設(shè)立基線數(shù)據(jù)，作為后續(xù)測試校準(zhǔn)的參照。對于疾病靶向基因檢測組套的實驗驗證應(yīng)包括基因與疾病的特異相關(guān)性，及廣譜的致病性突變基因。此外，還應(yīng)留意高度同源區(qū)域測序是否準(zhǔn)確。對于ES和GS，驗證的重點(diǎn)在于高質(zhì)量的外顯子/基因組等指標(biāo)上，比如外顯子/基因組應(yīng)達(dá)到平均覆蓋率或所含堿基的百分比應(yīng)達(dá)到最小覆蓋閾值。實驗室的任何變動，需使用先前的實驗樣本或特征性的參照樣本，進(jìn)行從頭到尾的測試驗證。

3.2性能參數(shù)的驗證

需要驗證的性能包括分析的靈敏度、特異性、重復(fù)性和重現(xiàn)性。參數(shù)可以從技術(shù)層面開始制定，必須能反映整個測試的操作過程。

4　NGS分析的質(zhì)量控制

實驗室必須制定質(zhì)量控制（quality control，QC）措施并用于監(jiān)測每個檢測，包括分析前、分析中及分析后的質(zhì)量監(jiān)測。監(jiān)測內(nèi)容包括樣本質(zhì)量、檢測參數(shù)、人員資質(zhì)、數(shù)據(jù)存儲、參考材料、能力驗證。

4.1樣本質(zhì)量要求

運(yùn)行NGS的DNA可從多種樣本中提取。實驗室應(yīng)規(guī)定樣本類型、最小樣本量等。不同樣本類型的DNA質(zhì)量和突變檢測需求并不一樣，實驗室需確定各種樣本類型的可接受指標(biāo)（例如樣本體積、組織量），制定實驗室操作手冊與DNA提取和定量分析的質(zhì)量管理方案，并在患者報告中注明這些參數(shù)。對于不符合要求的樣品需重新采樣，若無法重新采樣，在實驗室精通全基因組擴(kuò)增技術(shù)的前提下可行全基因組擴(kuò)增，在報告單上備注可能存在的固有偏差以便臨床醫(yī)生和患者能悉知該技術(shù)的局限性。在任何情況下，實驗室都應(yīng)把操作時間、方法學(xué)選擇等內(nèi)容錄入實驗室操作手冊中。

4.2檢測參數(shù)要求

實驗室應(yīng)建立QC監(jiān)測點(diǎn)來進(jìn)行質(zhì)量保證監(jiān)控。QC監(jiān)測的內(nèi)容包括：DNA質(zhì)量、測序過程中錯誤率的監(jiān)測、運(yùn)行后/分析前數(shù)據(jù)質(zhì)量的評估；QC操作記錄還應(yīng)包括使用的儀器和試劑批號。在驗證過程中，實驗室應(yīng)記錄偏離標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程的偏差及糾正措施；還必須記錄NGS數(shù)據(jù)分析中的生物信息學(xué)操作流程，記錄分析操作流程中的特殊性數(shù)據(jù)的情況；完善分析系統(tǒng)，以便實驗室追蹤軟件的版本及每個具體版本的特異性變化。

4.3人員資質(zhì)要求

從事NGS的技術(shù)人員應(yīng)該經(jīng)過專門的崗前培訓(xùn)并獲得資質(zhì)，在變異序列評估方面有豐富經(jīng)驗；通曉疾病的發(fā)病機(jī)制及NGS技術(shù)性能。若實驗室提供ES和GS服務(wù)，應(yīng)配備精通基因與突變及疾病表型之間關(guān)系的專家。

4.4數(shù)據(jù)存儲

NGS數(shù)據(jù)存儲方法應(yīng)遵循法規(guī)的要求，從而保證患者數(shù)據(jù)的可溯源性。實驗室應(yīng)在規(guī)程中明確標(biāo)明文件類型和確定每種類型的保存時間，建議實驗室每種文件類型至少保存2年以上，以便可以追溯初始實驗結(jié)果、分析流程改進(jìn)后重新分析的數(shù)據(jù)。此外，實驗室應(yīng)考慮記錄保留.vcf文件及相關(guān)變異亞型的最終臨床報告及解釋，條件允許時，可重新解釋突變基因與疾病相關(guān)的可能意義。

4.5參考材料

實驗室應(yīng)使用具有廣泛特征性的參考材料（reference materials，RMs）作為測序和拷貝數(shù)變異檢測的參照。Coriell提供的人類細(xì)胞系具有高度特異的基因組區(qū)域和非共有區(qū)域，這些材料已用于GS實驗，但要注意隨著時間推移基因組穩(wěn)定性降低的情況；此外，還有其他一些組織如美國病理家學(xué)會（College of American Pathologists，CAP），美國食品藥品監(jiān)督管理局用于評估儀器和測試性能的RMs。實際上，從全血中提取的基因組DNA是穩(wěn)定的，可通過全基因組擴(kuò)增技術(shù)，從少部分樣本中獲得大量可長期使用的DNA。通過計算方法獲得模擬電子序列作為RM，可以和QC或能力驗證的過程整合。這類模擬序列用于解決某一個特定區(qū)域的問題，如重復(fù)序列、已知的插入和缺失及SNPs。

4.6能力驗證

根據(jù)美國臨床實驗室改進(jìn)修訂（Clinical Labo?ratory Improvement Amendments，CLIA）的要求，必須建立能力驗證（proficiency testing）操作程序并且定期進(jìn)行能力驗證。實驗室須采用當(dāng)前公認(rèn)的能力驗證方法來進(jìn)行，若沒有其他實驗室進(jìn)行平行的NGS測試，則需要實驗室內(nèi)部自定的能力驗證方法來驗證。

5　測序申請單、報告格式和結(jié)果解釋

5.1測序申請單

基因檢測項目的申請要求開單醫(yī)生提供患者的詳細(xì)臨床資料，如患者的臨床特征、家族史及體格檢查等來申請遺傳學(xué)檢測，以便實驗室判斷檢測出的基因變異與患者一系列臨床癥狀、體征是否相符，以及對患者預(yù)后進(jìn)行評估。實驗室則根據(jù)醫(yī)生的要求進(jìn)行基因測試和報告所檢測的基因中潛在的致病變異，并說明檢測方法和每個檢測的操作參數(shù)。

5.2報告格式

實驗室主任確定報告的細(xì)節(jié)，報告必須清晰、簡明地闡明任何相關(guān)結(jié)果及其臨床意義，以便醫(yī)生對檢測結(jié)果的理解，并對所使用方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性進(jìn)行描述。

所有NGS報告必須包括已鑒定的突變列表，以人類基因組變異協(xié)會命名指南進(jìn)行注釋，并根據(jù)ACMG指南進(jìn)行臨床分類（該指南定期更新，實驗室應(yīng)關(guān)注該指南的變更情況）；另外，基因命名應(yīng)遵循人類基因組組織基因命名的命名法進(jìn)行。報告中需要詳細(xì)列出每個變異位點(diǎn)對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物的外顯子編號、任意突變、方法學(xué)、引用的互聯(lián)網(wǎng)站。建議實驗室以結(jié)構(gòu)形式來報告突變體數(shù)據(jù)，報告中還應(yīng)提供靶向區(qū)域、外顯子組或基因組有效區(qū)域水平的技術(shù)參數(shù)與分析檢測中的局限性；對于伴隨發(fā)現(xiàn)結(jié)果的報告，在符合公認(rèn)的醫(yī)學(xué)實踐和道德倫理的基礎(chǔ)上，實驗室應(yīng)制定相關(guān)的方案來決定某些類型的伴隨發(fā)現(xiàn)是否應(yīng)該報告、什么時候報告。

5.3結(jié)果解釋

根據(jù)ACMG指南，在疾病靶向基因檢測組套報告中每一種突變鑒定都需進(jìn)行評估并歸類，應(yīng)包括與疾病相關(guān)突變基因功能和基因產(chǎn)物可能性的循證評估。ES和GS測試中得到的實驗結(jié)果，除了鑒定變異是否會改變基因或蛋白質(zhì)功能外，還應(yīng)評估已知的基因斷裂表型與患者臨床表型是否相關(guān)；如果檢測到具有潛在臨床意義的多聯(lián)突變體，在解釋中應(yīng)討論每個突變體與患者的表型可能存在的相關(guān)性，并排列突變的優(yōu)先次序；ES和GS測試的報告中，對無任何疾病關(guān)聯(lián)的基因變異，即與診斷無關(guān)、意義未明的變異（variants of un?certain significance，VUSs），實驗室應(yīng)制定關(guān)于如何報告VUSs的規(guī)程，并且如實客觀地報告檢測中的首次發(fā)現(xiàn)，直至找到基因與疾病有關(guān)聯(lián)的證據(jù)，也鼓勵實驗室存儲臨床測序數(shù)據(jù)到公共數(shù)據(jù)庫中。

實驗室應(yīng)就遺傳學(xué)檢測結(jié)果數(shù)據(jù)再分析，及再分析是否另外收費(fèi)等相關(guān)問題制定明確的政策。建議實驗室定期與臨床溝通，并告知VUSs的相關(guān)知識是否已經(jīng)更新。測序結(jié)果的解釋必須慎重，實驗室必須與臨床保持充分溝通以避免產(chǎn)生不合理的解釋。

6　總結(jié)

探究遺傳異質(zhì)性疾病的病因是一項長期艱苦的工作，NGS克服了傳統(tǒng)Sanger測序中無法大規(guī)模測序的缺點(diǎn)。然而，從與疾病相關(guān)的基因組套到整個基因組，NGS在產(chǎn)生高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)的同時，還面臨著許多難題，包括處理大量信息的障礙，生物學(xué)上的解釋和數(shù)據(jù)的引用參考等等。未來關(guān)于該技術(shù)的具體臨床應(yīng)用還需要進(jìn)一步完善。

參考文獻(xiàn)

［1］Rehm HL，Bale SJ，Bayrak?Toydemir P，et al.Work?ing Group of the American College of Medical Genetics and Genomics Laboratory Quality Assurance Com?mitee.ACMG clinical laboratory standards for next?gen?eration sequencing［J］.Genet Med，2013，15（9）:733?747.

2.羅斯維爾帕克癌癥研究所腫瘤外科，美國，紐約，布法羅14263★通訊作者：黃華藝，E?mail:Huayi.Huang@Roswellpark.org

作者單位：1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，廣西，南寧530021

The standardization of the next generation sequencing technologies in clinical application：in reference to the ACMG clinical laboratory standards for next?generation sequencing

JIANG Liejun1，LU Xiaoxu1，HUANG Huayi1，2★
（1.Department of Laboratory Medicine，the People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning，Guangxi，China，530021；2.Department of Surgical Oncology，Roswell Park Cancer Institute，Elm &Carlton Streets，Buffalo，New York，USA，14263）

［ABSTRACT］Next?generation sequencing(NGS)technologies have been utilized in clinical laboratories. The advancement of technologies and expansion of the test scales and applications led to significant reductions in the cost of NGS test.The NGS technologies are still advancing in clinical laboratories,such as disease targeted gene panel,exome,and the whole genome sequencing.NGS technologies are also enhancing further advances in therapeutic decision making and disease prediction for populations who are at high risk of a potential disease.Nevertheless,the advancement of NGS is full of challenges in clinical applications including the fast update of platform and technologies leading to confusion in platform selection,the difficulties in clinical verification of sequencing data,etc.In order to help clinical laboratories with the validation of NGS methods and platforms,the ongoing monitoring of NGS testing to ensure quality results,and the interpretation and reporting of variants obtained using these technologies,this paper briefly summarized and discussed the standard and guidelines of NGS technologies in clinical applications in reference to the American College of Medical Genetics and Genomics to serve as a reference guidelines in establishing a local standard and guidelines for clinical laboratories in China.

［KEY WORDS］American College of Medical Genetics and Genomics；Next?generation sequencing；Disease?targeted gene panels;Exome sequencing；Genome sequencing