整合素αvβ8、p38及ERK1/2在膽道閉鎖患兒肝臟中的表達及意義

高婷，詹江華，丁美云，衛園園

整合素αvβ8、p38及ERK1/2在膽道閉鎖患兒肝臟中的表達及意義

高婷1，詹江華2△，丁美云1，衛園園1

摘要：目的研究轉化生長因子（TGF）-β1通路相關調節蛋白整合素αvβ8、p38及細胞外調節蛋白激酶1/2 （ERK1/2）蛋白在膽道閉鎖（BA）患兒肝臟中的表達情況及在肝纖維化進程中的作用。方法選取天津市兒童醫院普外科收治的BA患兒15例為Kasai組，膽管擴張癥患兒10例為膽擴組；天津市第一中心醫院小兒器官移植科行Kasai手術后因肝功能衰竭行肝移植的BA患兒10例為肝移植組。取患兒肝右葉前緣標本，行HE染色觀察肝纖維化程度，行免疫組化染色檢測αvβ8、p38及ERK1/2在肝組織中的表達情況。結果HE染色示，膽擴組偶見纖維細胞增生；Kasai組匯管區增寬，纖維組織增生、橋接纖維化現象普遍，可見假小葉形成；移植組匯管區明顯增寬，纖維組織增生較重，廣泛橋接纖維組織形成，假小葉明顯。免疫組化染色示，膽擴組αvβ8和ERK1/2表達為弱陽性，p38為陰性表達；Kasai組αvβ8、p38及ERK1/2蛋白均在肝細胞胞質、匯管區膽管上皮細胞胞質及血管內皮細胞胞質中強陽性表達；肝移植組αvβ8、p38及ERK1/2蛋白皆為強陽性表達。Kasai組和肝移植組αvβ8、p38及ERK1/2表達水平明顯高于膽擴組（均P＜0.05），Kasai組與肝移植組比較差異無統計學意義。結論αvβ8、p38及ERK1/2表達在BA肝纖維化過程中明顯增高，αvβ8、p38及ERK1/2可能參與并促進BA肝纖維進程。

關鍵詞：膽道閉鎖；肝硬化；p38絲裂原活化蛋白激酶類；絲裂原活化蛋白激酶1；肝纖維化；αvβ8；p38；ERK1/2

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81570471）；天津市衛生行業重點攻關項目（14KG129）；天津市衛生局科技基金資助項目（2014KR09）

作者單位：1天津醫科大學研究生院（郵編300070）；2天津市兒童醫院，天津市兒科研究所

作者簡介：高婷（1989），女，碩士在讀，主要從事小兒普外、膽道閉鎖方面的研究

△

通訊作者E-mail：zhanjianghuatj@163.com

1　資料與方法

1.1一般資料收集2014年1月—2016年3月間天津市兒童醫院普外科收治的BA患兒15例為Kasai組，男4例，女11例，日齡19～112 d，平均（63±28）d；膽管擴張癥患兒10例為膽擴組，男3例，女7例，日齡350～1 720 d，平均（820± 681）d；膽擴組及Kasai組均行肝臟活檢分別確診為膽管擴張癥及BA患兒，且均行Kasai手術。另收集2013年1月—2014年3月天津市第一中心醫院小兒器官移植科行Kasai手術后因肝功能衰竭行肝移植的BA患兒10例為肝移植組，男6例，女4例，日齡215～2 150 d，平均（1 030±499）d。實驗用標本取自患兒肝右葉前緣，用10%福爾馬林溶液固定8～24 h后，經石蠟包埋儲存。本研究經天津市兒童醫院及天津市第一中心醫院倫理委員會審查通過。

1.2主要試劑與儀器αvβ8抗體購自北京博奧生物技術有限公司；p38、ERK1抗體、二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔聚合物）、3，3-二氨基聯苯胺（3，3-diaminobenzidine,DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；ERK2抗體購自Santa Cruz Biotechnology,Inc。定量分析所采用的Image Pro Plus 5.0自動分析系統購自美國Media Cybernetics公司。

1.3組織學檢測將蠟塊標本連續4 μm切片，分別進行HE染色及免疫組化染色。（1）HE染色。病理切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水洗，浸染蘇木素5 min，酸化伊紅乙醇液浸染2 min，常規梯度乙醇脫水，透明劑浸泡至透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察肝組織細胞發育、肝纖維化程度。（2）免疫組化染色。病理切片常規脫蠟至水，經枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復15 min，冷卻至室溫，PBS沖洗5 min×3次，于3%H2O2，37℃中孵育10 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加一抗（αvβ8、p38、ERK1、ERK2均為1∶200），于冰箱中4℃過夜，取出置于室溫，PBS洗5 min×3次，加辣根過氧化物酶標記的二抗于37℃下孵育30 min，PBS洗5 min×3次，DAB顯色5 min，充分水洗，蘇木素液染核，常規脫水、透明、中性樹膠封片，在低倍鏡（×100）下觀察切片染色（棕色）區域，高倍鏡（×400）下辨別不同陽性細胞及其表達情況。

1.4免疫組化結果判斷參照文獻［5］免疫組化陽性判斷標準。（1）定性分析。高倍鏡下計算100個細胞中陽性細胞所占百分比，無陽性細胞為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，＞50%為3分。再根據染色強度定為無棕黃色0分、淡棕黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分。兩項評分相加判定結果：0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為陽性，5～6分為強陽性。（2）半定量分析。于每張切片陽性部位處讀取任意5個視野，用同一計算機成像系統留取100倍顯微鏡下圖片，Image pro-plus 5.0分析圖片計算αvβ8、p38、ERK1/2蛋白的平均光密度值（AOD），AOD=肝組織陽性細胞光密度總和/陽性細胞所占面積。

1.5統計學方法采用SPSS 17.0軟件包進行統計處理，正態分布的計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較滿足方差齊性采用Bonferroni法，方差非齊性采用Tamhane’s法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1HE染色結果膽擴組偶見纖維細胞增生；Kasai組匯管區增寬，纖維組織增生、橋接纖維化現象普遍，可見假小葉形成；肝移植組匯管區增寬，纖維組織增生較重，廣泛橋接纖維組織較重，假小葉明顯，見圖1。

2.2免疫組化定性分析結果 （1）αvβ8蛋白。在3組肝細胞、匯管區膽管上皮細胞及血管內皮細胞細胞質中均有表達，在膽擴組呈弱陽性表達，在Kasai組和肝移植組呈強陽性表達，見圖2A～C。（2）p38蛋白。在膽擴組匯管區膽管上皮細胞及血管內皮細胞呈陰性表達，在Kasai組及肝移植組肝細胞、匯管區膽管上皮細胞及血管內皮細胞胞質中強陽性表達，見圖2D～F。（3）ERK1/2蛋白。在膽擴組僅在血管內皮細胞、肝竇周圍細胞胞質中有弱陽性表達，在Kasai組及肝移植組不僅在血管內皮細胞、肝竇周圍細胞胞質中強陽性表達，還在膽管上皮細胞及肝細胞中呈強陽性表達，見圖3。

2.3免疫組化半定量分析結果Kasai組和肝移植組αvβ8、p38和ERK1/2蛋白表達水平均高于膽擴組（均P＜0.05），Kasai組與肝移植組比較差異無統計學意義，見表1。

Tab.1　Comparison of αvβ8,p38 protein and ERK1/2 expressions in liver in three groups表1　3組肝組織αvβ8、p38和ERK1/2蛋白表達水平的比較　　（±s）

Tab.1　Comparison of αvβ8,p38 protein and ERK1/2 expressions in liver in three groups表1　3組肝組織αvβ8、p38和ERK1/2蛋白表達水平的比較　　（±s）

＊P＜0.05；a與膽擴組比較，P＜0.05

組別膽擴組Kasai組肝移植組F n 10 15 10 αvβ8 0.106±0.009 0.147±0.023a0.147±0.012a21.397＊p38 0.103±0.005 0.134±0.018a0.151±0.016a23.121＊ERK1 0.113±0.011 0.133±0.019a0.143±0.018a5.633＊ERK2 0.118±0.018 0.147±0.017a0.156±0.009a10.412＊

3　討論

BA患兒肝臟以肝內、外膽管梗阻，進行性炎癥及肝纖維化為主要病理特征，早期行Kasai手術雖可以改善膽汁淤積，但不能使肝纖維化進程終止［6］。在BA肝纖維化進程中，TGF-β1信號通路蛋白在BA肝纖維化過程中起重要作用，TGF-β1信號通路激活后，誘導肝細胞胞質內Smad2/3磷酸化生成磷酸化-Smad2/3（p-Smad2/3），p-Smad2/3與Smad4形成絡合物，并移向細胞核，啟動細胞外基質蛋白的基因轉錄，從而促進肝纖維化進程［2，5］。αvβ8及相關激酶作為TGF-β1信號通路的調節蛋白，在肝纖維化中的作用已有較多研究［3，7］，但其在BA患兒肝臟中的表達情況尚少見報道。

3.1αvβ8參與激活TGF-β1通路來促進BA肝纖維化進展αvβ8作為一種細胞黏附分子，通過與TGF-β1上特定的潛在相關肽-1（latencyassociated peptide-1，LAP-1）區域相結合，然后促進膜型1-基質金屬蛋白酶（membrane-type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP）與TGF-β1上的LAP-1結合，進而使MT1-MMP 與αvβ8-TGF-β1形成復合物，通過其相互作用，激活TGF-β1信號通路［8-9］。本研究中αvβ8蛋白在3組中均有陽性表達，主要在肝細胞、匯管區膽管上皮細胞及血管內皮細胞細胞質中表達，但在膽擴組呈弱陽性表達，在Kasai組及肝移植組呈強陽性表達；Kasai組及肝移植組αvβ8蛋白表達水平較膽擴組高。另外，膽擴組偶見纖維細胞增生，而Kasai組和肝移植組纖維組織增生較重，提示αvβ8在肝纖維化過程中表達增多，可能參與BA肝纖維化進程。本研究與Iordanskaia等［10-11］的研究結果一致。本研究中Kasai組αvβ8蛋白表達水平與肝移植組無明顯差異，這可能與肝移植組選材時所處的肝纖維化分級情況及樣本量有關。3.2p38、ERK1/2通過參與TGF-β1信號通路相關蛋白磷酸化及核易位過程促進肝纖維化進程p38、ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路中的不同亞型，Jiang等［12］研究結果顯示p38、ERK1/2抑制劑通過阻斷Smad2/3磷酸化及p-Smad2/3與Smad4核易位，進而阻斷Smad2/3/4復合物形成，導致PAI-1蛋白及mRNA表達降低，提示MAPK信號蛋白參與并促進肝纖維化進程，目前MAPK信號通路在BA患兒肝臟中的表達屬于較新的研究領域。本研究結果顯示，p38、ERK1/2在BA患兒肝臟中肝細胞胞質、匯管區膽管上皮細胞及血管內皮細胞胞質等中強陽性表達，且其表達水平較對照組明顯增高，提示其可能在BA肝纖維化進程中起重要作用；而Kasai組與肝移植組比較差異雖無統計學意義，但在數值上較Kasai組高，提示p38、ERK1/2可能與肝纖維化嚴重程度有關，但尚需進一步研究驗證。

綜上所述，αvβ8、p38和ERK1/2表達在BA肝纖維化過程中明顯增高，αvβ8通過激活TGF-β1信號通路，進而促進肝纖維化進程；p38、ERK1/2通過影響TGF-β1信號通路蛋白磷酸化及核易位來促進肝纖維化進程。

（圖1～3見插頁）

參考文獻

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（2016-04-27收稿2016-05-12修回）

（本文編輯陳麗潔）

中圖分類號：R726.1

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20160362

The expression and significance of integrin αvβ8,p38 and ERK1/2 in the liver of children with biliary atresia

GAO Ting1，ZHAN Jianghua2△，DING Meiyun1，Wei Yuanyuan1
1 The Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;
2 Tianjin Children’s Hospital,Tianjin Pediatrics Institute△Corresponding AuthorE-mail：zhanjianghuatj@163.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression and significance of integrin αvβ8,p38 and extracellular signalregulated protein kinase 1/2(ERK1/2)proteins,which are TGF-β1 pathway related regulatory protein,in liver fibrosis of children with biliary atresia(BA).MethodsFifteen cases of BA(Kasai group)and 10 cases of congenital biliary dilatation (CBD group)were collected in Tianjin Children’s Hospital.And liver biopsy specimens were collected in Tianjin first central hospital,including 10 cases of BA children who underwent liver transplantation due to liver failure after Kasai operation (liver transplantation group).The specimens of front part of the right lobe of the liver were taken for HE and immunohistochemistry(IHC)staining.The expressions of αvβ8,p38 and ERK1/2 in liver were observed by IHC staining in three groups of liver tissues.ResultsHE staining showed fibroblast hyperplasia occasionally in CBD group,portal area expansion,fibrous tissue proliferation and wide spread bridging fibrosis with few pseudo lobules in Kasai group.In transplantation group,portal area was widened,the degree of fibrosis was severe and bridging fibrosis generally formed resulted in pseudo lobules widely.Imunohistochemistry showed that the expressions of αvβ8 and ERK1/2 were weakly positive,and the expression of p38 was negative in CBD group.In Kasai group,the expressions of αvβ8,p38 and ERK1/2 proteins were all strongly positive in liver cytoplasm,biliary epithelial cells and vascular endothelial cell cytoplasm.In liver transplantation group the expressions of αvβ8,p38 and ERK1/2 proteins were all strongly positive.The semi-quantitative analysis showed that the expressions levels of αvβ8,p38 and ERK1/2 were significantly higher in Kasai and liver transplantation groups than those of CBD group(P<0.05).There were no significant differences in expression levels of αvβ 8,p38 and ERK1/2 between Kasai group and transplantation group(P>0.05).ConclusionThe expressions of αvβ8,p38 and ERK1/2 are gradually increased in liver of BA with the process of fibrosis,which indicate that they may be involved inthe process of BA liver fibrosis.

Key words:biliary atresia;liver cirrhosis;p38 mitogen-activated protein kinases;mitogen-activated protein kinase 1; liver fibrosis;αvβ8;p38;ERK1/2膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是嬰幼兒期最嚴重的肝膽系統疾病之一，主要以肝內外膽管進行性炎癥、纖維性梗阻及膽汁淤積為特點，導致進行性肝纖維化和肝硬化，如不及時治療，常在1歲左右死亡［1］。目前BA的主要治療方法為早期行肝門-空腸吻合術（Kasai手術），但肝纖維化進程并不隨著 Kasai手術而停止。轉化生長因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）通路與肝纖維化進程密切相關，而整合素αvβ8、p38及細胞外調節 蛋白 激 酶 1/2（extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2）對 TGF-β1通路的激活及Smad2/3蛋白磷酸化等起重要作用［2-4］。但以上3種蛋白在BA肝組織中的表達情況尚不明確，本文旨在檢測αvβ8、p38及ERK1/2在BA肝組織中的表達情況，并探討其在BA肝纖維化中的作用機制。