纈沙坦對糖尿病腎病大鼠腎臟TRPC6表達的影響

任直親，范慧，李芳芳青島市中心醫院腎病消化內科，山東青島　266300

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纈沙坦對糖尿病腎病大鼠腎臟TRPC6表達的影響

任直親，范慧，李芳芳
青島市中心醫院腎病消化內科，山東青島266300

［摘要］目的探討纈沙坦對糖尿病腎病（DN）大鼠腎臟TRPC6表達的影響。方法高脂高糖喂養聯合小劑量鏈脲佐霉素建立DN模型，將模型大鼠隨機分為兩組:模型對照組（DN組）與纈沙坦治療組（DV組），另設正常對照組（NC組）。干預8周末測生化指標及24 h尿蛋白，光鏡觀察大鼠腎臟病理改變，免疫組化法測腎臟Nephrin、TRPC6表達并作半定量分析。結果與NC組相比DN組大鼠表現為高血糖、高血脂、胰島素抵抗和蛋白尿，病理出現系膜基質增多，Nephrin表達減低而TRPC6表達增高。經纈沙坦治療后Nephrin表達增加，TRPC6表達顯著降低。TRPC6與尿蛋白呈正相關，Nephrin的與尿蛋白呈負相關。結論DN大鼠腎臟出現足細胞損傷和TRPC6表達增加，纈沙坦可通過下調TRPC6的表達而發揮足細胞保護作用。

［關鍵詞］纈沙坦；糖尿病腎病；TRPC6

足細胞損傷是糖尿病腎病（DN）發生發展的一個重要環節。足細胞裂孔隔膜是腎小球濾過屏障的關鍵組成部分，瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（TRPC6）是新近發現的裂孔隔膜蛋白，目前研究表明TRPC6是血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的足細胞凋亡過程中的重要分子，參與DN發生發展。目前纈沙坦對糖尿病腎病大鼠腎組織TRPC6的表達有何影響，國內外報道較少。該研究觀察DN大鼠腎臟Nephrin、TRPC6的表達以及纈沙坦對其表達的影響。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑

纈沙坦。STZ:用前溶解在0.01 mL/L枸櫞酸緩沖液中，pH4.5。血胰島素（INS）試劑盒。Nephrin、TRPC6（兔抗人多克隆抗體）。免疫組化試劑盒。

1.2動物模型建立和分組

雄性SD大鼠50只，體重（200±20）g，隨機分為模型組（高糖高脂喂養，n=40）和正常對照組（NC組，n=10）。NC組給予常規飼料喂養，模型組給予高糖高脂飲食，喂養8周后，模型組大鼠空腹狀態下予鏈脲佐菌素（STZ，30 mg/kg）一次性腹腔注射。NC組僅注射等量枸櫞酸緩沖液。模型組注射STZ 1周后，測定24 h攝食量、尿量，測定體重、尿白蛋白排泄率（UAL），鼠尾靜脈取血測定空腹血糖（FBG）、胰島素（INS）、血甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、血肌酐（Scr），并計算胰島素抵抗指數（FBG×INS/22.5，HOMA-IR）。FBG大于正常大鼠血糖均值+3個標準差（該研究確定該值為FBG≥10.0 mmol/L），胰島素抵抗指數大于正常均值者為胰島素抵抗。將造模成功的大鼠隨機分為兩組:模型對照組（DN組）和纈沙坦治療組［DV組，纈沙坦50 mg/（kg·d）］。NC組與DN組每日給予等量自來水灌胃。實驗周期為8周。

1.3標本檢測

INS按照試劑盒說明書，采用ELISA法測定。FBG、Scr、TG、TC、UAL用自動生化分析儀檢測。

1.4腎臟組織病理

光鏡部分:腎組織置中性10%福爾馬林中固定，制成3 μm厚的切片，行常規HE染色。

1.5免疫組化方法

采用SP免疫組織化學染色技術，操作步驟按試劑盒說明書進行。一抗為Nephrin、TRPC6多克隆抗體（1: 200，1:150）。棕色為陽性信號。先低倍鏡下觀察，然后在200倍光鏡下，隨機分別采集皮質區30個視野內的腎小球，用全自動圖像分析系統，計數其積分光密度（IOD）值，取其均值分析。

1.6統計方法

應用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，計量數據用均數±標準差（x-±s）表示，各組間均數差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。指標之間的關系采用Peasson直線相關分析。

2　結果

2.1各組大鼠物理及生化指標變化

28只大鼠成功造模，出現TG、TC明顯升高及胰島素抵抗，造模成功率70%。DN組TG、TC、KW、KW/BW明顯高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）。DV組TG、TC、KW、KW/BW比DN組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。DN組UAL明顯高于NC組（P＜0.05），DV組UAL明顯低于DN組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　各組大鼠常規指標的比較（±s）

表1　各組大鼠常規指標的比較（±s）

注:與NC組相比，*P＜0.05；與DN組相比，**P＞0.05；與DN組相比，△P＜0.05。

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2.2腎臟病理學態觀察

光鏡檢查結果:HE染色顯示，與NC組比較DN組表現出腎小球體積增大，腎小球基底膜增厚，系膜基質增生，腎小球毛細血管壁狹窄；經纈沙坦治療后，以上改變較DN組改善。

2.3免疫組化結果

NC組可見Nephrin在大鼠腎小球呈線性分布，DN 組nephrin表達明顯減少，纈沙坦治療后Nephrin表達上調。NC組TRPC6在腎小球呈弱表達，主要分布在腎小球，沿腎小球毛細血管袢及系膜區分布，DN組TRPC6表達顯著增強，纈沙坦治療后腎小球TRPC6表達明顯下調，但仍強于NC組。DN組大鼠TRPC6蛋白IOD均值顯著高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）。nephrin蛋白IOD均值顯著低于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）。DV組大鼠TRPC6蛋白IOD均值較DN組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；但仍高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.01）。nephrin蛋白IOD均值高于DN組，差異有統計學意義（P＜0.05）；但仍低于NC組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2　各組大鼠腎小球TRPC6、Nephrin蛋白的比較（x-±s）

2.4相關性分析

TRPC6與UAL呈正相關，差異有統計學意義（r= 0.96，P＜0.01）；Nephrin與UAL呈負相關，差異有統計學意義（r=-0.88，P＜0.01）。

3　討論

該實驗在南京軍區總醫院郭嘯華［1］動物模型基礎上，應用高脂高糖喂養8周誘導出胰島素抵抗，再聯合小劑量STZ腹腔注射造成胰島β細胞輕度損傷，同時減少對其他臟器損傷，成功建立了2型糖尿病大鼠模型。較符合人類2型糖尿病的發病過程及代謝特征。

糖尿病腎病發病機制非常復雜，近來研究表明足細胞損傷是糖尿病腎病發生發展的一個重要環節。足細胞的結構功能異常是DN發病機制的中心環節，Nephrin 及TRPC6為重要的足細胞膜蛋白并在維系足細胞正常生物學功能中發揮重要作用［2］。越來越多的證據表明，糖尿病時腎臟局部的RAS是激活的［3］。作為RAS激活的產物血管緊張素II（Angll）的活性逐漸受到關注。Tom Nijenhuis研究［4］證實Ang II通過NFAT信號通路上調TRPC6的表達，引起體外培養的小鼠足細胞的損傷。近年大量的研究表明，血管緊張素受體阻斷劑或者血管緊張素轉換酶抑制劑可以降低DN患者及糖尿病腎病鼠的尿蛋白，從而延緩DN的進展［5］。

為研究DN的發病機制及DN早期改變，越來越多的研究關注糖尿病足細胞相關蛋白的表達。Nephrin可以作為足細胞損傷的一個早期指標［6］。該研究觀察纈沙坦對糖尿病腎病大鼠腎臟病理改變和腎組織Nephrin、TRPC6表達的影響。結果發現DN組大鼠腎組織Nephrin表達明顯減少，而TRPC6表達顯著增強，兩者與尿蛋白增加明顯相關。纈沙坦治療后Nephrin表達上調，纈沙坦治療后腎小球TRPC6表達明顯下調，蛋白尿明顯減少。提示纈沙坦可能通過調節Nephrin、TRPC6的表達，減輕糖尿病大鼠腎臟足細胞的損傷，發揮保護腎臟的作用。有關具體信號通路機制有待進一步研究。

［參考文獻］

［1］郭嘯華，劉志紅，李恒，等.實驗2型糖尿病大鼠模型的建立［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2000，9（4）:351-355.

［2］Estacion，Li S，Sinkins W，et al.Activation of human TRPC6channelsbyreceptor stimulation［J］.J Bio I Chem，2004，279 （21）:22047-22056.

［3］Kennefick TM，Anderson S.Role of angiotensin II in diadetic nephropathy［J］.Semin Nephr，1997，17:441-447.

［4］Nijenhuis T，Sloan AJ，Hoenderop JG，et al.Angiotensin II Contributes to Podocyte Injury by Increasing TRPC6 Expression via an NFAT-Mediated Positive Feedback Signaling Pathway［J］.Am J Pathol，2011，179（4）:1719-1732.

［5］Fujisawa T，Ikegami H，ono M，et a1.Combination of half doses 0f angiotensin type 1 receptor antagonist and angiotensin-converting enzyme inhibitor in diabetic nephropathy［J］.Am J Hypertens，2005，18（1）:13.

［6］Eto N，Wada T，Inagi R，et a1.Podocyte protection by darbepoetin:preservation of the cytoskeleton and Nephrin expression［J］. Kidney Int，2007，72（4）:455-463.

［中圖分類號］R4

［文獻標識碼］A

［文章編號］1672-4062（2016）06（a）-0048-02

DOI:10.16658/j.cnki.1672-4062.2016.11.048

收稿日期:（2016-03-07）

［作者簡介］任直親（1986.8-），女，山西運城人，碩士研究生，住院醫師，研究方向:糖尿病腎病。