消痰通腑方對結腸癌SW480細胞磷脂酶A2、環氧合酶2表達及細胞生物學行為的影響

胡學謙 朱童 王丹 魏品康

摘要：目的 觀察消痰通腑方對結腸癌SW480細胞增殖、遷移的影響，探討其分子作用機制。方法 采用不同濃度消痰通腑方作用結腸癌SW480細胞，CCK8法和平板克隆形成實驗檢測細胞增殖，Transwell小室實驗檢測細胞遷移能力，RT-qPCR檢測磷脂酶A2（PLA2）和環氧合酶2（COX-2）mRNA表達，Western blot檢測PLA2和COX2蛋白表達，RNA干擾技術沉默SW480細胞株中PLA2基因表達。結果 消痰通腑方低、高劑量組較對照組結腸癌SW480細胞增殖能力明顯減弱（P<0.05），克隆形成率及遷移能力明顯下降（P<0.05，P<0.01），PLA2、COX-2 mRNA和蛋白表達均明顯下調（P<0.05），并呈濃度依賴性；與質粒對照組和對照組比較，PLA2 shRNA干擾組細胞PLA2和COX2蛋白表達明顯下調（P<0.05）。結論 消痰通腑方可抑制結腸癌SW480細胞增殖和遷移，其機制可能與PLA2及COX-2的表達下調有關。

關鍵詞：消痰通腑方；磷脂酶A2；環氧合酶2；結腸癌SW480細胞

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.014

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0050-04

結腸癌是常見的惡性腫瘤，其發病率在男性和女性中分別位居第3位和第2位，且有逐年上升趨勢[1]。

結腸癌屬中醫學“腸蕈”范疇，多因飲食失節、脾胃受損、濕熱壅聚成痰而搏結腸腑所致。消痰通腑方為魏品康教授從痰論治消化道腫瘤核心治則“消痰散結八法”之一。磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一類可催化脂肪酸水解并產生以花生四烯酸（arachidonic acid，AA）為主的游離脂肪酸酶，具有產生炎性介質、參與細胞信號轉導等多種功能，在人類腫瘤發生、發展中發揮重要生物效應[2]。環氧化酶（cyclooxygenase，COX）是PLA2催化AA生成生物活性分子的限速酶，包括COX-1和COX-2。研究表明，COX-2在結腸中過度表達，其與細胞增殖、分化等有關[3]。本研究采用消痰通腑方干預結腸癌SW480細胞，觀察其對細胞增殖、遷移的影響，探討其分子作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞株

人結腸癌SW480細胞，中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物及制備

消痰通腑方由制半夏、制南星、大黃、陳皮、雞內金、炙甘草組成，所有飲片由上海雷允上藥業有限公司提供。消痰通腑方由第二軍醫大學試劑中心制備，按比例（制半夏15 g，制南星15 g，大黃6 g，陳皮15 g，雞內金15 g，炙甘草6 g）稱取10倍量的飲片，加8倍體積的75%乙醇，回流提取煎煮2次，每次1 h，將煎液合并后離心、濃縮、干燥至干品即得消痰通腑方醇提物，其得率為1 g原藥材/0.26 g。等比例換算至藥物濃度分別為2.24、8.96 g/mL。實驗前稱取適量醇提物干粉，經渦旋、超聲、水浴等方法使其充分溶解于DMEM培養基后，0.22 μm濾器過濾并配置成所需濃度的溶液，4 ℃冰箱貯存備用。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM培養基，胎牛血清（FBS），0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液，qPCR、cDNA反轉錄、總RNA提取試劑盒，transwell小室，CCK8溶液，PLA2抗體，COX-2抗體，PLA2 shRNA質粒，shRNA對照質粒，shRNA質粒轉染試劑，均購自Santa cruz公司。

超凈工作臺（廣州深華生物技術有限公司），CO2培養箱、BIOMATE型紫外可見分光光度計（Thermo），LXJ-ⅡA型離心機（上海安亭科學儀器廠），GE4852 型PCR儀（杭州柏恒科技有限公司），DYCZ-24DN電泳儀（北京六一儀器廠），Tocan500全自動凝膠成像系統（南京裴爾森生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養及藥物干預

結腸癌SW480細胞常規培養于含10%FBS和1%青-鏈霉素雙抗DMEM培養基，每隔1～2 d換液，待細胞融合約80%時進行細胞傳代及種板。消痰通腑方原藥材濃度為8.96 g/mL，經0.22 μm無菌過濾器過濾，用培養基稀釋成實驗所需濃度。實驗根據藥物濃度分為對照組（0 g/mL）、低劑量組（2.24 g/mL）、高劑量組（8.96 g/mL）。

2.2 CCK-8法檢測

取對數生長期上述3組細胞，經胰酶消化后，接種于96孔板，每孔細胞數為1×103。每組設5個復孔。分別于24、48、72、96、120 h后加10 μL CCK-8溶液。置于培養箱培養4 h，于酶標儀波長450 nm處測定細胞吸光度（A）值，計算細胞相對增殖率[（實驗組A值-對照組A值）÷對照組A值×100%]。

2.3 平板克隆形成實驗

取對數生長SW480細胞懸液梯度倍比稀釋后，接種于6孔板中，每孔50個細胞。置于培養箱內培養24 h，各組分別加入各濃度消痰通腑方溶液，重新置于培養箱中，經常觀察，當出現肉眼可見克隆時，棄去上清液，PBS清洗2次，甲醇溶液固定15 min后加Gimesa染液染色。計算克隆細胞數目。實驗重復3次，取其平均值。

2.4 Transwell小室實驗

收集3組細胞，800 r/min離心5 min，PBS清洗2次，用培養基重懸并調整細胞濃度為1×109/L。分別取100 μL細胞液置于Transwell小室上層，同時在下層加500 μL DMEM培養基。37 ℃培養箱中培養48 h，擦凈小室濾膜上層的細胞。4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗并用結晶紫染色。每組同時做3個重復小室，200倍顯微鏡下計數并拍照。

2.5 RT-qPCR檢測結腸癌SW480細胞磷脂酶A2和環氧合酶2 mRNA表達

從Gene Bank網站獲取PLA2、COX-2基因序列，并使用Premier5.0軟件設計引物（見表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用Trizol試劑提取細胞總RNA，每份樣品均取2 μg，按試劑盒說明進行反轉錄。以Tubulin為內參，PLA2、COX-2表達的相對定量值用于統計分析。

2.6 Western blot檢測結腸癌SW480細胞磷脂酶A2和環氧合酶2蛋白表達

用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解并收集細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后加入上樣緩沖液，煮沸變性。樣品進行SDS-PAGE電泳，電轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，特異性一抗4 ℃搖床過夜，洗膜后，二抗孵2 h，EC顯影。

2.7 shRNA轉染實驗

人結腸癌SW480細胞分為PLA2 shRNA干擾組、質粒對照組、對照組，每組設3個復孔。以2 μg PLA2 shRNA質粒和對照質粒分別轉染SW480細胞，轉染24 h后，用5 μg/μL嘌呤霉素篩選細胞株，繼續培養24 h。對照組為不加任何處理的SW480細胞。

3 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 消痰通腑方對結腸癌SW480細胞增殖的影響

高劑量組較對照組增殖能力明顯減弱（P<0.05），低劑量組也能抑制細胞增殖但效果不如高劑量組，結果見圖1。高劑量組克隆形成率為（48.38±3.67）%、低劑量組為（121.13±2.64）%，較對照組（205.65±3.72）%明顯降低（P<0.05，P<0.01），結果見圖2。

4.2 消痰通腑方對結腸癌SW480細胞侵襲能力的影響

消痰通腑方作用48 h，低、高劑量組較對照組穿膜細胞數明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結果見圖3。

4.3 消痰通腑方對結腸癌SW480細胞磷脂酶A2和環氧合酶2 mRNA和蛋白表達的影響

消痰通腑方作用72 h，PLA2、COX-2 mRNA和蛋白表達量均顯著降低，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）；高劑量組較低劑量組差異更顯著（P<0.05）。結果圖4、圖5。

4.4 PLA2 shRNA干擾后消痰通腑方對結腸癌SW480細胞磷脂酶A2和環氧合酶2蛋白表達的影響

PLA2 shRNA干擾48 h，與質粒對照組和對照組相比較，轉染PLA2 shRNA質粒的SW480細胞PLA2蛋白表達明顯受到抑制，PLA2 shRNA干擾成功。同時，COX-2的表達與PLA2的表達具有一致性。結果見圖6。

5 討論

中醫學認為，結腸癌多因飲食失節，嗜食肥甘厚膩，困遏脾土，而致脾胃受損，脾運化失常，濕濁內生，氣機阻滯，精微不能正常布散而發病。濕聚為痰，熱煉津為痰，故濕熱壅聚則久能生痰，搏結腸腑，致腸腑濕熱重滯，氣機運化不暢，大腸傳導失司，痰熱濕濁不能及時排除體外而在體內停聚，日久形成積塊而成痰結[4]。

消痰通腑方為魏品康教授從痰論治消化道腫瘤的經驗用方。研究表明，該方可抑制炎癥因子引發的炎癥反應[5-6]。方中制半夏、制南星為消痰散結之君藥，大黃、炒枳實殼清熱通腑為臣藥，雞內金、陳皮理氣消積，顧護脾胃為佐使，炙甘草調和藥性，共奏消痰散結祛除痰結、清熱通腑推陳出新。PLA2是磷脂代謝的關鍵酶之一，可分解磷脂產生AA從而進一步產生COX-2、前列腺素E2（PGE2）等炎性介質，從而引發炎癥。研究表明，PLA2的活化與多種腫瘤相關[7-9]。慢性炎癥促進腫瘤的發生發展涉及多條細胞內信號通路，其中PLA2-COX-2-PGE2信號通路是其重要途徑之一。研究表明，結直腸癌的發展常伴隨著COX-2基因過度表達，其過度表達可通過促進細胞的增殖、存活，進而在腫瘤進展中發揮重要作用[10]。

本實驗結果顯示，與對照組比較，高劑量組能降低結腸癌細胞增殖能力（P<0.05），抑制結腸癌細胞的遷移（P<0.01）。低劑量組雖不如高劑量組效果好，但與對照組比差異有統計學意義（P<0.05）。而且消痰通腑方能降低結腸癌SW480細胞PLA2及COX-2的表達，PLA2 shRNA干擾實驗進一步證實PLA2與COX-2的表達存在一致性，提示消痰通腑方可能通過降低PLA2的表達從而下調AA通路下游靶基因COX-2來調控結腸癌的增殖與遷移。

綜上所述，本研究表明消痰通腑方可以抑制人結腸癌細胞SW480的增殖和遷移。其機制可能與抑制PLA2及AA通路中COX-2的表達有關，為消痰通腑方用于結腸癌的治療提供了實驗依據，但其體內的具體作用機制仍需進一步研究。

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