PNPLA3基因與非酒精性脂肪性肝病發生發展相關性研究

錢建成金燕羅燕施軍平

PNPLA3基因與非酒精性脂肪性肝病發生發展相關性研究

錢建成1金燕1羅燕2施軍平2

目的分析中國成人非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者PNPLA3基因多態性與肝臟損害的相關性，探討遺傳因素在中國成人NAFLD發生和發展中的作用。方法連續收集106例NAFLD患者和100名年齡、性別相匹配的健康人。用測序分型法和Taqman探針分型法分別測定所有納入者rs738409、rs2281135的單核苷酸多態性（SNP）。同時測定患者肝功能（ALT、AST、GGT）、空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，以及血壓、身高、體質量、體質量指數（BMI）；用穩態模型評估法計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）。結果rs738409突變純合型GG型NAFLD組（40.6%）高于健康對照組（13.0%），CC型則NAFLD組（17.9%）低于健康對照組（44.0%），差異有統計學意義（P＜0.05)，攜帶等位基因G的NAFLD患者CG/GG組較CC組具有更高谷丙轉氨酶（ALT）[（82.03± 61.25）U/L比（53.84±38.78）U/L，P＜0.05]、谷氨酰轉肽酶（GGT）[（83.66±52.92）U/L比（56.42±34.02）U/L，P＜0.01]；rs2281135突變純合型AA型NAFLD組（24.5%）高于健康對照組（15.0%），野生GG型則NAFLD組（26.4%）低于健康對照組（44.0%），差異有統計學意義（P＜0.05），攜帶突變基因A的患者較GG純合子具有更高ALT[（85.52±61.63）U/L比（53.18±32.62）U/L、GGT[（84.08±54.21）U/L比（64.00±37.85）U/L，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論PNPLA3 rs738409和rs2281135多態性與NAFLD遺傳易感性有顯著相關性；PNPLA3 rs738409等位基因G和rs2281135等位基因A可增加肝損害（ALT、GGT）的風險，且與胰島素抵抗無相關性。

非酒精性脂肪性肝病；PNPLA3；單核苷酸多態性

隨著肥胖癥和糖尿病全球化的流行趨勢，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已成為全球性的嚴重公共衛生問題，不僅可導致肝硬化、肝癌、殘疾和死亡，還與2型糖尿病、動脈粥樣硬化性心腦血管疾病以及腫瘤的高發密切相關[1]。國內外研究證明，含patatin樣磷脂酶域3（PNPLA3）基因突變與NAFLD密切相關[2-5]。本研究通過對NAFLD患者和健康人群rs738409和rs2281135進行基因型檢測，分析中國漢族成人非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者PNPLA3基因多態性與肝臟損害的相關性。

1 臨床資料

連續收集106例非酒精性脂肪性肝病患者和100名健康體檢者，均為2012年1月—2013年1月在杭州市第六人民醫院和杭州師范大學附屬醫院就診、體檢的無血緣關系的浙江地區的漢族人群。診斷標準：NAFLD診斷參照2010年中華醫學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組制定的NAFLD診療指南[1]。NAFLD組106例，男88例，女18例，平均年齡（39.68±12.47）歲；健康對照組100名，男88名，女12名，平均年齡（36.95±2.70）歲。兩組年齡、性別差異無統計學意義（P＞0.05）。NAFLD組體質量指數（BMI）高于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）與健康對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2 方法

2.1 生化指標檢測兩組均采集次日空腹靜脈血，離心后血清標本送檢，谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、谷氨酰轉肽酶（GGT）、空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等指標采用日立7060全自動生化分析儀測定；空腹胰島素（FINS）采用化學免疫發光法測定；穩態模型評估法計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）。

2.2 基因提取使用血液基因組提取試劑盒（杭州愛思進生物技術有限公司）從EDTA抗凝全血中提取DNA，具體步驟如下：（1）加500μL buffer AP1到1.5mL的離心管中；（2）加250μL抗凝全血到buffer AP1中，用移液器來回吸注幾次以徹底溶解殘留在吸頭上的血液，蓋緊離心管子，旋渦震蕩10s；（3）100μL bufferAP2旋渦震蕩10s；（4）12 000g離心10min；（5）將制備管置于2mL離心管中，將步驟4中的濾液加入到制備管中，12 000g離心1min；（6）棄濾液，將制備管回到原2mL離心管中，加入700μL bufferW1A，室溫放置2min，12 000g離心30s；（7）棄濾液，將制備管回到原2mL離心管中，加入800μL已加無水乙醇的bufferW2，12 000g離心1min；（8）將制備管回到原2mL離心管中，加入500μL bufferW2到制備管中，12 000g離心1min；（9）棄濾液，將制備管回到原2mL離心管中，12 000g離心1min；（10）將制備管置于另一潔凈的1.5mL離心管中，在silica膜中央加入100μL bufferTE，室溫靜置1min，12 000g離心1min，洗脫DNA,棄柱，液體-20℃度保留。

2.3 測序分型法對rs738409基因型分型（1）使用Primer Express Software v3.0軟件設計引物：Primer A：5'-GCCAGCTGTGGCTACTCTGT-3'；Primer B：5'-TCAGTCCATGAGCCAACAAC-3'，（2）PCR：擴增條件：預變性94°C 3min，變性94°C 30s，退火60.5°C 30s，延伸72°C 1min，終末延伸72°C 5min，變性、退火和延伸設置30個循環。（3）測序：測序儀器為3730xl DNA Analyzer，測序試劑為BigDye terminator v3.1，測序方法為雙脫氧鏈終止法。

表1 兩組研究對象一般情況比較（）

表1 兩組研究對象一般情況比較（）

注：NAFLD：非酒精性脂肪性肝病；BMI：體質指數；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓

組別NAFLD組健康對照組t值（或χ2值）P值例數106 100性別（男/女）88/18 88/12 1.030 0.100年齡（歲）39.68±12.47 36.95±2.70 1.550 0.123 BMI（kg/m2）26.45±5.75 21.74±2.56 7.473 0.000 SBP（mmHg）122.91±12.14 119.65±11.32 1.973 0.054 DBP（mmHg）79.98±9.14 78.13±8.81 1.398 0.164

表2 兩組研究對象生化學指標比較（）

表2 兩組研究對象生化學指標比較（）

注：NAFLD：非酒精性脂肪性肝病；ALT：谷丙轉氨酶；GGT：谷酰轉肽酶；FBG：空腹血糖；TG：總甘油三酯；TC：總膽固醇；LDL-C低密度脂蛋白膽固醇；UA：尿酸；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇

組別NAFLD組健康對照組t值P值例數106 100 ALT（U/L）77.90±58.97 18.51±9.79 9.940 0.000 GGT（U/L）68.43±49.01 20.63±10.81 9.500 0.000 FBG（mmol/L）6.08±1.71 5.25±0.42 4.675 0.000 TG（mmol/L）2.18±1.38 1.09±0.50 7.347 0.000 TC（mmol/L）5.38±1.07 4.55±0.72 6.337 0.000 HDL-C（mmol/L）1.35±0.43 1.49±0.29 -2.569 0.009 LDL-C（mmol/L）3.44±1.02 2.35±0.53 9.395 0.000 UA（mmol/L）382.89±96.61 274.65±73.46 8.602 0.000

2.4 Taqman探針分型法對rs2281135基因型分型（1）DNA模板稀釋準備：根據紫外分光光度計所測濃度，將提取的核酸樣品用純水稀釋至終濃度為1.33ng/μL；（2）Real-time PCR：依次向96孔反應板中加入Universal PCR Master Mix、SNP Genotyping Assays（ID：C__15875080_10）和稀釋好的DNA模板，光學貼膜密封后振蕩混勻、離心，放入Real-time熒光定量PCR儀7900HT中，設置反應條件，擴增篩選相應片段。PCR擴增條件：預變性95°C 10min，變性92°C 15s，退火/延伸60°C 1min，變性、退火/延伸設置40個循環；（3）SNP基因型解讀分析：將PCR反應后的96孔反應板再次放入Real-time熒光定量PCR儀7900HT中，利用ABI公司The Sequence Detection System（SDS）軟件進行讀板分析，機器根據檢測到的不同熒光強度，可以判斷相應樣本的SNP等位基因型。

2.5 統計學方法應用SPSS16.0統計軟件，計算統計基因頻率，結果進行Hardy-Weinberg吻合度測驗樣本的群體代表性；計數資料用率表示，采用χ2檢驗，計量資料進行正態分布檢驗，符合正態分布的計量資料用（） 表示，兩組間計量資料的比較用t檢驗，多組間計量資料的各項指標比較采用單因素方差分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 兩組研究對象生化學指標比較NAFLD組谷丙轉氨酶（ALT）、谷酰轉肽酶（GGT）、空腹血糖（FBG）、總甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、尿酸（UA）高于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）低于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。

3.2 PNPLA3 rs738409基因變異對NAFLD的影響

3.2.1 兩組研究對象rs738409基因型和等位基因分布的比較經Hardy-Weinberg吻合度平衡檢驗，確認rs738409基因頻率已達到遺傳平衡，樣本有群體代表性（P＞0.05）。NAFLD組rs738409CC、CG和GG基因型及等位基因C、G的頻率與健康對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖1～2（插頁）。

表3 兩組研究對象rs738409基因型和等位基因分布的比較[例（%）]

3.2.2 rs738409基因型與脂肪肝患者一般情況和生化指標相關性分析脂肪肝患者中CG/GG基因型ALT、GGT高于CC純合型，且差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；CG/GG基因型較CC純合型擁有更高的TG，差異有統計學意義（P＜0.01）。此外，CG/GG基因型TC、LDL-C、FBG、FINS、HOMA-IR均高于CC基因型，CG/GG基因型HDL-C低于CC基因型，但差異均無統計學意義（P＞0.05），見表4。

3.3 PNPLA3 rs2281135基因變異對NAFLD的影響

3.3.1 兩組研究對象rs2281135基因型和等位基因分布比較經Hardy-Weinberg吻合度平衡檢驗，確認rs2281135基因頻率已達到遺傳平衡，樣本有群體代表性（P＞0.05）。NAFLD組rs2281135AA、AG和GG基因型及等位基因A、G的頻率與健康對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表5、圖3（插頁）。

3.3.2 rs2281135基因型與脂肪肝患者一般情況和生化指標相關性分析脂肪肝患者中AG/AA基因型ALT、GGT高于GG純合型，且差異有統計學意義（P＜0.05）。AG/AA基因型TG、TC、LDL-C、FBG、FINS、HOMA-IR均高于GG基因型，AG/AA基因型HDL-C低于GG基因型，但差異均無統計學意義（P＞0.05），見表6。

表4 106例脂肪肝患者rs738409基因型與一般情況和生化指標相關性分析（）

表4 106例脂肪肝患者rs738409基因型與一般情況和生化指標相關性分析（）

注：NAFLD：非酒精性脂肪性肝病；BMI：體質指數；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；ALT：谷丙轉氨酶；GGT：谷酰轉肽酶；FBG：空腹血糖；TG：總甘油三酯；TC：總膽固醇；LDL-C低密度脂蛋白膽固醇；UA：尿酸；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；FINS：空腹胰島素；HOMA-IR：穩態胰島素評價指數

rs738409 CC CG/GG t值P值BMI（kg/m2）24.65±6.41 26.89±5.54 -1.552 0.124 SBP（mmHg）121.18±11.68 123.30±11.30 -0.650 0.517 DBP（mmHg）80.71±9.54 79.82±9.67 0.343 0.732 ALT（U/L）53.84±38.78 82.03±61.25 -2.550 0.015 GGT（U/L）56.42±34.02 83.66±52.92 -2.822 0.007 TG（mmol/L）1.99±1.09 3.14±2.16 3.048 0.003 rs738409 CC CG/GG t值P值TC（mmol/L）5.30±1.04 5.80±1.19 1.643 0.104 HDL-C（mmol/L）1.36±0.22 1.34±0.46 0.140 0.889 LDL-C（mmol/L）3.36±0.96 3.86±1.21 1.777 0.079 FBG（mmol/L）5.95±1.60 6.68±2.12 1.559 0.123 FINS（μU/L）13.83±9.45 14.7±9.43 -0.308 0.759 HOMA-IR 3.85±2.68 3.97±2.69 0.152 0.880

表5 兩組研究對象rs2281135基因型比較[例（%）]

4 討論

含patatin樣磷脂酶域3（patatin-like phospholipase domain containing 3，PNPLA3）位于22號染色體上,所編碼的蛋白又被稱為adiponectin，蛋白由481個氨基酸組成的，屬于patatin樣磷脂酶家族[4]，patatin是一種可溶的蛋白質，在馬鈴薯根莖中廣泛存在，具有脂肪酰化水解酶活性[5]，可能與肝臟脂代謝有關，但就其致病機制仍無詳細闡釋。部分觀點認為PNPLA3作為patatin樣磷脂酶家族，考慮其可能有三酰甘油水解酶活性從而影響肝臟脂肪代謝；也有觀點認為PNPLA3突變干擾了脂質轉運的過程。2008年，Romeo等[6]首次應用全基因組關聯分析對NAFLD進行了致病基因的篩選，研究選取西班牙裔美國人、非洲裔美國人和歐洲裔美國人等組成的群體，發現PNPLA3基因rs738409多態性與肝臟脂肪含量的水平增加及肝臟炎癥顯著相關，與HOMA-IR無相關性,其引起肝損傷機制可能與肝內脂質沉積有關，尤其是脂毒性引起的肝損傷。此外，Speliotes等[7]研究1997例歐洲受試者，發現PNPLA3 rs738409的G等位基因增加NFALD的發生（OR=3.26，P＜0.05），與體質指數、甘油三酯水平、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白或糖尿病無關（P＞0.05）；PNPLA3 rs2281135的A等位基因與血清ALT增加有關（OR=2.43，P＜0.05）。

本研究納入106例NAFLD患者和100名健康人，分別使用測序分型法和Taqman探針分型法對rs738409和rs2281135進行基因型檢測，實驗過程中比較兩種實驗方法，發現Taqman探針分型法操作簡單快速，軟件分析結果清晰，標出了每個樣本的基因型及熒光強度，非常直觀，特別適合少量位點大量樣本的分型，且全程可自行操作，但是Taqman探針訂購周期較長，長達1～2個月，且保存要求高，故不適合時間較緊迫和小樣本的實驗。而測序分型法直接獲得序列信息，在此基礎上查找具體SNP位點變化，其特點是準確性高，實驗周期短，但費用較大，后期測序必須交予生物公司實行測序服務，不適合大量樣本的分型。

表6 106例脂肪肝患者rs2281135基因型與一般情況和生化指標相關性分析（）

表6 106例脂肪肝患者rs2281135基因型與一般情況和生化指標相關性分析（）

注：NAFLD：非酒精性脂肪性肝病；BMI：體質指數；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；ALT：谷丙轉氨酶；GGT：谷酰轉肽酶；FBG：空腹血糖；TG：總甘油三酯；TC：總膽固醇；LDL-C低密度脂蛋白膽固醇；UA：尿酸；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；FINS：空腹胰島素；HOMA-IR：穩態胰島素評價指數

rs2281135 GG AA/AG t值P值BMI（kg/m2）25.49±6.01 26.80±5.66 1.001 0.319 SBP（mmHg）120.82±10.61 123.56±12.57 0.925 0.358 DBPmmHg）79.72±8.93 80.06±9.86 0.140 0.889 ALT（U/L）53.18±32.62 85.52±61.63 2.566 0.012 GGT（U/L）64.00±37.85 84.08±54.21 2.130 0.037 TG（mmol/L）2.08±1.19 2.52±1.86 -1.278 0.205 HOMA-IR 3.47±2.17 4.03±2.81 0.738 0.463 rs2281135 GG AA/AG t值P值TC（mmol/L）5.33±1.06 5.58±1.12 -0.827 0.411 HDL-C（mmol/L）1.35±0.47 1.32±0.24 0.263 0.889 LDL-C（mmol/L）3.38±0.97 3.63±1.15 1.777 0.793 FBG（mmol/L）5.99±1.65 6.39±1.93 0.949 0.345 FINS（μU/L）12.31±7.03 15.32±10.03 1.201 0.234

對于rs738409，本實驗研究發現NAFLD組和健康對照組均存在CC、CG、GG三種基因型，但各基因型在兩組分布不同，NAFLD組突變純合型GG型高于健康對照組，CC型則低于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），結果表明等位基因G在NAFLD中占比例較大，提示rs738409等位基因G與人群中發生NAFLD具有相關性。比較不同基因型脂肪肝患者的實驗室指標發現，攜帶等位基因G的NAFLD患者CG/GG組較CC組具有更高ALT、GGT和TG（P＜0.05，P＜0.01），說明rs738409等位基因與脂肪含量的水平增加及肝臟炎癥有關系，這與Romeo等[6]研究結果一致。另一方面雖然CG/GG組較CC組具有更高的FBG、FINS、HOMA-IR，但是差異沒有統計學意義（P＞0.05），說明與胰島素抵抗無關，其造成肝損的機制可能是通過其他生物路徑[2，8-13]，這與Kantartzis K等[9]的研究結果一致。類似的結果出現于rs2281135，AA、AG和GG基因型均在脂肪肝組和健康對照組中檢出，NAFLD組突變純合型AA型高于健康對照組，野生型GG則低于健康對照組，且差異有統計學意義（P＜0.05），結果表明等位基因A在NAFLD中占比例較大，提示rs2281135等位基因A與人群中發生NAFLD具有相關性，對NAFLD組不同基因型的生化指標作比較，同樣發現攜帶突變基因A的患者較GG純合子具有更高ALT、GGT，且有統計學意義（P＜0.05），不同于rs738409的是TG差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，通過本研究，我們認為在浙江地區的漢族人群中，PNPLA3 rs738409和rs2281135多態性與NAFLD遺傳易感性有顯著相關性，同時PNPLA3 rs738409等位基因G和rs2281135等位基因A可增加肝損害（ALT、GGT）的風險，且與胰島素抵抗無相關性。

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（收稿：2015-12-20修回：2016-03-05）

Correlation of the PNPLA3 Gene with Non-alcoholic Fatty Liver Disease

QIAN Jiancheng1,JIN Yan1,LUO Yan2,SHI Junping2.1 Department of Infectious Disease,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou (310012),China;2 Laboratory of Translational Medicine,the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, Hangzhou(310015),China

ObjectiveTo analyze the correlation of adult non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）patients' PNPLA3 gene polymorphism with liver damage,and to explore the genetic factors in the occurrence and development in Chinese NAFLD patients.MethodsHundred and six patients with NAFLD and 100 age-and sexmatched healthy people were continuously collected in this study.Sequencing typing method and Taqman probe typing method were used to measure the single nucleotide polymorphism（SNP）of rs738409,rs2281135 in subjects. Subjects'liver function（ALT,AST,GGT）,fasting blood glucose（FBG）,fasting insulin（FINS）,total cholesterol（TC）, triglyceride（TG）,high density lipoprotein cholesterol（HDL-C）,and low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）levels were determined and blood pressure,height,weight,body mass index（BMI）were measured;homeostasis model assessment insulin resistance index（HOMA-IR）was calculated.ResultsThe PNPLA3 rs738409 genotype GG was observed in 40.6%patients of NAFLD group and in 13.0%healthy subjects;the genotype CC was observed in 17.9%patients of NAFLD group and in 44.0%healthy subjects,both with a significant difference（P＜0.05）.Patients carrying the G allele（CG/GG）in NAFLD group had significant higher levels of ALT and GGT compared with patients with CC genotype（ALT：82.03±61.25U/L vs 53.84±38.78U/L and GGT：83.66±52.92U/L vs 56.42±34.02U/L; all P＜0.05）.The PNPLA3 rs2281135 mutant genotype AA was observed in 24.5%patients in NAFLD group and in15.0%healthy subjects;the GG type was observed in 26.4%patients in NAFLD group and in 44.0%healthy subjects,both with a significant difference（P＜0.05）.Patients carrying the A allele in NAFLD group had higher levels of ALT and GGT compared with patients with GG homozygotes with a statistically significant difference（ALT：85.52±61.63U/L vs 53.18±32.62U/L and GGT：84.08±54.21U/L vs 64.00±37.85U/L;all P＜0.05）.ConclusionPNPLA3 rs738409 and rs2281135 polymorphism is correlated with NAFLD genetic susceptibility.Patients with PNPLA3 rs738409 G allele and rs2281135 allele A may have higher risk of liver damage（ALT,GGT）,but no insulin resistance.

non-alcoholic fatty liver disease;PNPLA3;single nucleotide polymorphisms

1浙江省立同德醫院感染科（杭州310012）；2杭州師范大學附屬醫院轉化醫學平臺（杭州310015）

施軍平，E-mail：davidshi0571@126.com