豫南煙區煙草青枯病菌的致病力及遺傳多樣性分析

李小杰，李淑君，陳玉國，王海濤，李成軍，趙鳳霞，李彥平

（河南省農業科學院煙草研究所，河南 許昌 461000）

豫南煙區煙草青枯病菌的致病力及遺傳多樣性分析

李小杰，李淑君*，陳玉國，王海濤，李成軍，趙鳳霞，李彥平

（河南省農業科學院煙草研究所，河南 許昌 461000）

為有效防控豫南煙區煙草青枯病，對來自信陽市羅山縣、駐馬店市確山縣和遂平縣的煙草青枯病菌的致病力和遺傳多樣性進行了測定分析。人工接種試驗表明，豫南煙區煙草青枯病菌的致病力分為強、中和弱3種，不同寄主來源的煙草青枯病菌具有顯著的致病力差異。從100個隨機引物中篩選出8個擴增條帶清晰且具有豐富多態性的引物用于不同地區煙草青枯病菌菌株DNA的RAPD分析，共擴增出720條帶，其中多態性帶占88.9%。聚類結果和遺傳相似系數分析顯示，供試菌株可分為A、B兩大類，遺傳相似系數范圍為0.49～1.00，且供試菌株間的遺傳相似性與其地理來源有一定的相關性。綜上所述，豫南煙區煙草青枯病菌的致病力存在明顯差異且其DNA具有豐富的遺傳多樣性。

豫南煙區；煙草青枯病菌；致病力；遺傳多樣性

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的，在世界范圍內廣泛分布、危害嚴重的細菌性煙草根莖病害，目前在我國長江流域及其以南煙區普遍發生，造成了巨大的損失[1-2]。同時由于氣候等方面的原因，該病害發生有向北擴展蔓延趨勢。目前，河南、安徽、山東、陜西等地均有煙草青枯病的發生并造成不同程度的損失[3-6]。青枯雷爾氏菌具有顯著的生理分化現象[7-8]，不同地理來源和來自不同寄主植物的病原菌在致病力等方面存在著較大差異。目前有關青枯菌致病力的研究已有許多報道，何自福等[9]利用鑒別寄主的方法將31個茄科青枯菌菌株分為強致病力、中等致病力和弱致病力3個組群，表明其致病力存在明顯差異；黎妍妍等[10]、王國平等[11]、陳曉敏等[12]根據煙草青枯病菌在不同煙草品種上的致病力強弱，將其分為不同的致病型或致病力類群。正因為青枯雷爾氏菌的致病力分化如此顯著，從而導致青枯病的防治更加困難，因此對青枯菌進行致病性分析對病害防治具有重要的指導意義。

植物青枯菌菌株間的致病性差異的本質有可能在于其遺傳物質DNA的變異，近年來，已有研究者開始利用分子生物學技術研究青枯菌菌株間的遺傳差異[13-16]，這些研究結果都表明了青枯菌的DNA存在著豐富的遺傳多樣性。本研究在前人研究的基礎上，利用RAPD分子標記技術對河南省煙草青枯病菌進行了遺傳差異分析。

本研究對豫南煙區煙草青枯病菌的致病力以及遺傳多樣性進行研究，旨在探討不同來源青枯菌的致病力差異以及進化和親緣關系，為指導煙草品種的合理布局和病害預測與防治提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株從河南省信陽市羅山縣、駐馬店市確山縣和遂平縣采集分離到的19個煙草青枯菌菌株作為供試菌株。

1.1.2供試煙草品種河南省主栽品種中煙100作為供試煙草品種。

1.1.3培養基菌株分離培養基（TTC）：多聚蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，牛肉浸膏3 g，蔗糖10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL。分離時在基本培養基中加入氯化三苯基四氮唑（TTC），終濃度為0.05%。

1.2方法

1.2.1煙草青枯病菌的致病力測定將供試菌株分別在選擇性TTC瓊脂平板上劃線，28℃下培養48 h后，用無菌水配制成濃度為3×l08cfu/mL的細菌懸浮液供接種用。在溫室條件下按常規方法育苗，幼苗長至4～6葉時供接種使用。采用葉片注射接種法測定各菌株的致病力：從煙株頂芽往下數第3片葉背的葉脈，用滅菌的4號針頭將菌液注射到葉肉細胞間隙，并對葉片正面進行噴水保濕處理。每處理接種5株煙苗，煙苗置于28℃、濕度70%的條件下培養，每天觀察并記錄各處理煙苗發病情況，直至病情穩定。

病情分級標準：0級，無明顯癥狀；1級，葉片皺縮，注射區沒有褪綠變黃；2級，注射區形成黃色壞死斑；3級，注射區形成褐色壞死斑；4級，注射區壞死斑明顯擴展，葉片萎蔫；5級，整片葉片萎蔫；6級，植株枯萎死亡。

致病力評價標準：根據青枯病菌菌株對寄主致病力的強弱平均病級，分為3個類群：A群（強致病力），平均病級>4；B群（中等致病力），3≤平均病級≤4；C群（弱致病力），平均病級<3。

1.2.2不同致病力的青枯菌在煙苗組織內的含菌量檢測制備菌懸液，濃度為3×l08cfu/mL，每株10 mL灌根接種，煙苗為4～6葉期。每處理15株，3個重復，同時設置清水對照。28℃ 12 h光照培養，于接種后10 d取樣，取樣部位為煙株莖基部。每1 g樣本加入3 mL無菌水進行充分研磨，按10倍梯度稀釋，分別取不同稀釋液0.1 mL涂布于TTC培養基上，28℃培養72 h后進行平板菌落計數，然后換算成每克鮮重青枯菌量。公式如下：

利用DPS軟件對結果進行方差分析。

1.2.3煙草青枯病菌的RAPD分析基因組DNA提?。簩⑶嗫菥杲臃N在NA固體培養基上，25℃條件下培養48 h，用滅菌水懸浮菌體，根據細菌基因組提取試劑盒（生工生物）說明書提取基因組DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和完整性，貯存于-20℃冰箱中備用。

RAPD分析：從100個隨機引物中篩選得到8個條帶清晰、多態性好的引物（表1）用于青枯菌DNA 的RAPD分析，引物由生工（上海）生物技術有限公司合成。RAPD反應總體系為25 μL，各反應組分終濃度為：1.25 U Taq DNA聚合酶，10 μmol/L引物1 μL，2.5 mmol/LdNTPs 2μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，DNA模板40 ng。PCR擴增反應程序為：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，37℃退火90 s，72℃延伸2 min，41個循環；72℃ 延伸10 min；4℃保存。PCR產物經電泳分離后，記錄每條引物每個菌株的擴增結果。對電泳結果采用有帶記為“1”、無帶記為“0”的方法記錄譜帶。利用NTSYS2.1分析軟件，對結果以非加權算術平均數配對（unweighted pair group method with arithmetic averages，UPGMA）進行聚類分析，自動生成相似性系統數和樹狀圖進行聚類分析并構建種間及種內的系統聚類圖。

表1　篩選出的隨機引物以及擴增的條帶數Table 1　Number of fragments amplified with 8 primers selected from 100 random primers

2　結果

2.1豫南煙區煙草青枯病菌的致病性

菌株接種后72 h開始出現典型癥狀，一般在15 d左右病情穩定。根據煙草青枯菌菌株對寄主致病力的強弱，將19個供試菌株分為3個類群：A群（強致病力群），占供試菌株的42.1%；B群（中等致病力群），占供試菌株的42.1%；C群（弱致病力群），占供試菌株的15.8%（表2）。其中強致病力菌株主要分布在駐馬店確山縣瓦崗鎮，寄主煙草品種以云煙87為主；中等致病力菌株主要分布在駐馬店遂平縣玉山鎮，寄主煙草品種以中煙100為主。由此表明，不同寄主來源的煙草青枯病菌之間具有明顯的致病力差異。

2.2不同致病力的煙草青枯病菌在煙株體內的繁殖情況

接種后10 d，不同菌株導致煙株發病情況有很大差異。對不同發病癥狀的具有代表性的煙株進行體內青枯病菌含量測定（圖1），結果表明，接種強致病力菌株TXLLJ14-3的煙株體內青枯病菌的含量較高，且極顯著差異于接種中等致病力菌株TSP14-2和SP14-3的煙株體內的含菌量，而接種弱致病力菌株TXLT14-2的煙株體內含菌量為最少。由此表明，供試煙草青枯病菌的致病力與其在寄主體內的繁殖量成正比。

表2　分離菌株的致病性強弱類群Table 2　Groups of pathogenicity of isolates

圖1　接種不同煙草青枯病菌的煙株體內含菌量Fig.1　Determination of the amount of bacteria in tobacco plant after inoculation of tobacco bacterial wilt

2.3煙草青枯病菌的RAPD分析

利用篩選出的8條引物對上述不同地區具有代表性的10個煙草青枯病菌菌株進行RAPD分析。PCR擴增結果表明，擴增條帶表現出明顯的多態性，且條帶大小主要分布在0.35～5.0 kb。供試的8條引物所標記出的總的DNA指紋譜帶數為720條，其中多態性條帶640條，多態檢測率為88.9%，表明8條隨機引物對供試煙草青枯病菌菌株有豐富的遺傳多態性。圖2為隨機引物S27和S29的擴增結果。

圖2　隨機引物S29和S27的RAPD擴增結果Fig.2　RAPDproductsamplifiedwithrandomprimeS29andS27

聚類分析結果表明（圖3），供試的10個菌株大體可以聚為A、B兩大類，當取相似值0.67時，A類又可分為2個群，A1群包括1個來自信陽羅山縣龍井鄉云煙87品種的青枯病菌菌株，A2群包括2個來自信陽羅山縣檀崗村中煙201品種的青枯病菌菌株；當取相似值0.74時，B類也可分為2個群，其中B1群包括2個來自信陽羅山縣龍井鄉云煙87品種的青枯病菌菌株和3個來自駐馬店遂平縣玉山鎮中煙100品種的青枯病菌菌株，B2群包括2個來自駐馬店確山縣瓦崗鎮云煙87品種的青枯病菌菌株。以上聚類分析結果表明，10個供試煙草青枯病菌菌株中不同地理來源的菌株之間存在著明顯的遺傳差異，相同地理來源的菌株之間存在著遺傳相似性。

圖3　煙草青枯病菌的RAPD聚類分析樹狀圖Fig.3　Dendrogram based on RAPD analysis of R. solanacearum from tobacco

3　討論

關于青枯菌致病力分化的研究，大多數研究者都采用了鑒別寄主植物的方法來研究其致病力差異[9-12]，但他們均沒有對不同致病力的青枯菌在寄主植物體內的繁殖情況進行定量分析。本研究通過人工接種試驗，將豫南煙區煙草青枯病菌的致病力分為強、中、弱3種類型，其中強致病力菌株的寄主煙草品種以云煙87為主，中等致病力菌株的寄主煙草品種以中煙100為主，這可能是導致青枯菌菌株之間致病力差異的主要原因。同時，本研究還首次表明，青枯菌的致病力差異與其在寄主體內的繁殖量呈明顯的正相關性。

目前應用分子生物學技術如RAPD（隨機擴增多態性DNA）[9,13-14]、RFLP[15]、MLST（多位點序列分型）等[16]分子標記從基因水平上來研究不同青枯菌菌株間的DNA多態性的報道還比較少。本研究首次對豫南煙區煙草青枯病菌進行了RAPD分析，結果表明，供試煙草青枯菌菌株的DNA有著豐富的遺傳多態性，且不同地理來源的青枯菌菌株之間存在著明顯的遺傳差異，但這種遺傳差異與菌株的致病性之間無明顯相關性，這與前人研究結果基本一致[9,12-13]。因此，關于豫南煙區煙草青枯病菌的致病性與遺傳多樣性的關系還有待進一步研究。

值得注意的是，豫南煙區為河南省煙草青枯病首次發現的新病區，且青枯菌的寄主品種中煙100為河南省的主栽品種，這就增加了青枯病在河南省范圍內的傳播機會，因此，為防止煙草青枯病在河南省其他各主產煙區的擴大危害，要盡量避免地區間的煙苗運輸和跨地區田間操作。

4　結論

對豫南煙區煙草青枯病菌進行了致病力和遺傳多樣性分析，明確了煙草青枯病菌的致病力差異。RAPD分析結果表明，不同地理來源的青枯菌菌株之間存在著明顯的遺傳差異，但這種遺傳差異與菌株的致病性之間無明顯相關性。研究結果為河南省煙草青枯病的預測預報及防治提供了依據。

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Analysis of Pathogenicity and Genetic Diversity of Ralstonia Solanacearum on Tobacco in Southern Henan Province

LI Xiaojie,LI Shujun*,CHEN Yuguo,WANG Haitao,LI Chengjun,ZHAO Fengxia,LI Yanping
(Tobacco Research Institute of HenanAcademy ofAgricultural Sciences,Xuchang,Henan 461000,China)

In order to take effective measures to control tobacco bacterial wilt in Henan Province,the pathogenicity and genetic diversity of Ralstonia solanacearum from tobacco in Luoshan,Queshan and Suiping counties of Henan Province were investigated. The results showed that all the isolates could be divided into three pathogenic types including strong,medium and week pathogenicity by artificial inoculation.Also,the R.solanacearum strains from different hosts showed significant difference in pathogenicity.Eight primers which were screened from 100 primers were used in RAPD analysis of R.solanacearum Isolates.A total of 720 bands were obtained and 88.9%of them were polymorphic.Based on clustering and similarity analysis,the tested isolates fell into two groups and the genetic similarity among different strains was from 0.49 to 1.00.Moreover,the genetic similarity might be related to different geographical origin.In summary,the R.solanacearum isolates infecting tobacco in southern Henan Province showed obvious differentiation of pathogenicity with abundant genetic diversity.

tobacco area in southen Henan province;tobacco bacterial wilt;differentiation of pathogenicity;genetic diversity

S435.72

1007-5119（2016）03-0062-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.03.011

河南省煙草公司科技項目“河南省煙草青枯病的病原鑒定及防控技術研究”（HYKJ201407）；河南省基礎與前沿技術研究計劃項目“豫南煙區煙草青枯病菌的種群分析及與寄主互作機理研究”（152300410142）

李小杰（1983-），女，博士，助理研究員，主要研究方向為煙草植保。E-mail：lixiaojie000631@sina.com

，E-mail：13603749396@126.com

2015-11-12

2016-01-20