連翹揮發油對兩種煙草倉儲害蟲的毒殺作用

吳　彥，郭姍姍，韋建玉，張文娟，白　森，鄧賓玲，黃東業，白家峰，杜樹山*

（1.廣西中煙工業有限責任公司技術中心，南寧 530001；2.北京師范大學中藥資源保護與利用北京市重點實驗室，北京100875）

連翹揮發油對兩種煙草倉儲害蟲的毒殺作用

吳彥1，郭姍姍2，韋建玉1，張文娟2，白森1，鄧賓玲1，黃東業1，白家峰1，杜樹山2*

（1.廣西中煙工業有限責任公司技術中心，南寧 530001；2.北京師范大學中藥資源保護與利用北京市重點實驗室，北京100875）

為開發新型煙草倉儲防護劑，研究連翹果實揮發油的化學成分及其對煙草倉儲害蟲的殺蟲活性。通過GC-MS分析了連翹果實揮發油的化學成分，運用柱色譜和核磁共振方法分離并鑒定化合物，通過熏蒸、觸殺試驗測試揮發油及單體成分活性。結果表明，連翹揮發油對煙草甲和赤擬谷盜熏蒸活性的LC50值分別為8.94和7.68 mg/L；觸殺活性的LD50值分別為23.66和30.13μg/頭。單體化合物中，4-萜品醇對煙草甲的熏蒸和觸殺毒性最強（LC50值為6.90 mg/L；LD50值為8.62μg/頭）。另外，α-蒎烯，γ-萜品烯和4-萜品醇對兩種倉儲害蟲均具有較好的熏蒸和觸殺活性。因此，連翹揮發油及其單體化合物對煙草甲和赤擬谷盜均具有一定防治作用。

煙草倉儲；連翹；揮發油；煙草甲；赤擬谷盜

煙葉及成品卷煙在儲藏、加工、銷售過程中均易遭受蟲害。在儲存期，煙草倉儲害蟲對煙葉所造成的影響輕則降低等級，重則完全不能使用，給國家造成了經濟損失[1-2]。據報道，我國約有30多種儲煙害蟲，其中煙草甲（Lasioderma serricorne Fabricius）為優勢種，赤擬谷盜（Tribolium castaneum Herbst）為僅次于優勢種的種類[3]。防治煙草倉儲害蟲的方法主要是通過磷化氫熏蒸，但由于長期使用，害蟲已對其產生了一定的抗藥性[4]，而且化學農藥會對環境和人類健康造成一定影響，因而此法也越來越受到相關法規的制約[5-7]。

由于煙草倉儲害蟲化學防治的上述問題，植物源殺蟲劑成為替代合成化學農藥防治害蟲的良好選擇。以天然產物為主要活性成分的植物源殺蟲劑一般容易降解，不會對土壤與水源形成持久性影響，對脊椎動物安全性較高，并可控蟲害的再猖獗[8]。植物精油是植物源殺蟲劑的主要種類，研究發現其對害蟲具有觸殺、熏蒸、忌避、拒食、抑制生長發育等作用[9-10]，因而越來越受到廣泛關注[11]。

連翹為木樨科連翹屬植物[Forsythia suspensa (Thunb.)Vahl]，分布于我國山東、山西、河南、陜西等省[12]。連翹的干燥果實作為中藥連翹（Forsythiae Fructus）使用，主要成分為苯乙醇及其苷類化合物、木脂素及其苷類化合物、五環三萜類化合物、黃酮類化合物和揮發油等[13]。目前關于連翹揮發油的研究較多，但主要集中在抗菌，利尿，抗炎等藥理作用方面[14-18]，而對煙草倉儲害蟲的毒殺作用及其有效成分則鮮見報道。因此本研究以連翹揮發油及分離單體化合物為實驗材料，以煙草倉儲害蟲煙草甲和赤擬谷盜為靶標昆蟲，進行殺蟲活性試驗，為開發新型煙草倉儲防護劑以及有效防治煙草倉儲害蟲提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

1.1.1試蟲煙草甲和赤擬谷盜蟲源來自于河南工業大學糧油食品學院，在培養箱（溫度28～30℃，相對濕度70%～80%）中人工飼養純化3代以上。

1.1.2樣品木樨科植物連翹F.suspensa的干燥果實購于河北省安國藥材市場。連翹果實樣本(BNU-CMH-Dushuahan-2013-09-023-016)保存于北京師范大學資源學院北京市重點實驗室。連翹果實揮發油（23 mL）由1.3 kg藥材按照參考文獻[19]的方法制得，并于4℃冰箱保存。

1.1.3儀器和試劑TRACE 200GC/2000MS氣相色譜–質聯用儀（Thermoquest公司），質譜檢索NIST譜庫，GHP–9160隔水式恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；移液槍（量程范圍0.1～2.5、0.5～10和10～100μL，大龍興創實驗儀器有限公司）；Heidolph Laborota 4000型旋轉蒸發儀（德國）；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵（河南鞏義科工貿有限公司）；MettlerAE240電子天平（瑞士METTLER公司）；BrukerAvance DRX 500核磁共振譜儀（德國布魯克公司）。正己烷、乙醚、無水硫酸鈉等均為分析純（北京北化精細化學品有限責任公司）。

1.2方法

1.2.1分析方法GC-MS條件：色譜柱HP-5MS （30 m×0.25 mm×0.25 μm）熔融石英毛細管柱；載氣流速1.0 mL/min恒流模式；進樣口溫度250℃，傳輸線溫度250℃；進樣量1 μL，無分流模式；電離方式：EI；離子源溫度：230℃；電離能量：70 eV；四極桿溫度：150℃；掃描范圍：50～550 amu。經計算機檢索NIST數據庫，比對各峰值的MS裂片并結合有關文獻譜圖解析，鑒定化合物種類。采用峰面積歸一化法，根據各化學成分的分子質量，計算出各化學成分在揮發油中的相對百分含量（質量分數）。

1.2.2操作方法連翹果實揮發油10 mL，經正相硅膠柱層析，采用正己烷、正己烷–乙酸乙酯、乙酸乙酯依次梯度洗脫分段，獲得38個餾分段，再經石油醚–丙酮（100:1，體積比）反復硅膠柱層析分離，最終分別從餾分段4-7、12-16和26-29中獲得3種單體化合物。經鑒定分別為α-蒎烯[20]（3.31 g）、4-萜品醇[21]（0.37 g）和γ-萜品烯[22]（0.17 g）。

參照文獻[19]的方法測定揮發油及單體化合物對煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸及觸殺活性。每個實驗重復3次。

1.2.3測定方法處理后置于恒溫培養箱中培養24 h，觀察死亡情況前先用力搖動玻璃瓶，再將玻璃瓶倒置，5 min后觀察，蟲體不動即為死亡。并計算死亡率與校正死亡率。死亡率=（死蟲數/試蟲數）×100%；校正死亡率=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）×100%。

1.2.4統計分析方法采用SPSS21.0統計軟件分析計算致死中濃度LC50(mg/L)和半數致死量LD50(μg/頭)[23]。

2　結果

2.1化學成分分析

由表1看出，連翹果實揮發油為黃色，出油率為1.68%。從連翹揮發油中鑒定出18種化合物，占總含量的94.30%，主要成分為α-蒎烯（63.72%），b-乙酸松油酯（7.47%），4-萜品醇（6.67%），3-異丙基甲苯（3.54%）和γ-萜品烯（2.54%）。氣相色譜圖見圖1。

2.2生物活性

2.2.1熏蒸活性由表2可知，連翹揮發油對煙草倉儲害蟲煙草甲和赤擬谷盜均有較強的熏蒸毒殺作用，但揮發油對赤擬谷盜的熏蒸毒殺作用更強。分離出的3種化合物對煙草甲的熏蒸毒性強度最大的是4-萜品醇（LC50=6.90 mg/L），而對于赤擬谷盜的熏蒸毒性強度最大的是γ-萜品烯（LC50=4.09 mg/L），這說明不同的化合物對靶標昆蟲的作用存在個體性差異。

表1　連翹果實揮發油化學成分及其相對含量Table 1　Chemical constituents of the essential oil derived from F.suspensa fruits

圖1　連翹果實揮發油GC-MS氣相色譜圖Fig.1　Gas chromatogram plot of F.suspensa fruits essential oil

2.2.2觸殺活性由表3可知，連翹揮發油對煙草倉儲害蟲煙草甲和赤擬谷盜均有一定的觸殺毒性。在分離出的化合物當中，4-萜品醇對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺毒性都最強。但與陽性對照相比，4-萜品醇對煙草甲的觸殺毒性的LD50是除蟲菊素的35.92倍，對赤擬谷盜的觸殺毒性的LD50是除蟲菊素24.85倍，效果相對較弱。

3　討論

本研究當中所測得的連翹揮發油成分與以往文獻相比較，種類和含量有所不同?？捉艿萚26]采用毛細管氣相色譜-質譜聯用儀測定出的連翹揮發油成分主要為α-側柏烯(23.8%)，4-甲基-1-(1-甲基乙基)-3-環己烯醇-1(6.82%)，α-3-環己烯甲醇-1(6.82%)，2-異丙烯基-5,5-二甲基環戊烯(5.20%)和檸檬烯(5.20%)。使用超臨界CO2萃取技術，段文錄等[27]對河南盧氏連翹進行揮發油提取，測定出主要成分為乙酸羽扇烯酸酯(17.07%)，β-蒎烯(16.59%)，角鯊烯(7.56%)和三十六烷(5.39%)等。這說明植物由于生態環境、生長年限等不同可能導致其揮發油成分組成及含量的差異，另外，采樣時間、儲存時間、提取方法和檢測儀器等的不同也可能會使結果出現變化[28-30]。所以為了保證揮發油具有穩定的化學成分和殺蟲活性，必須保證原植物從生長到加工的每一環節都盡量減少自然因素和人為因素的影響。

表2　連翹果實揮發油及單體對煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性Table 2　Fumigant toxicity of the essential oil of F.suspensa fruits and its constituents against L.serricorne and T.castaneum adults

表3　連翹果實揮發油及單體對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性Table 3　Contact toxicity of the essential oil of F.suspensa fruits and its constituents against L.serricorne and T.castaneum adults

與以往研究相比較，連翹揮發油的殺蟲活性較強。其對赤擬谷盜的熏蒸活性強于地楓皮（Illicium difengpi）[31]和三脈紫菀（Aster ageratoides）[32]，對煙草甲的熏蒸活性強于茴藿香（Agastache foeniculum），對赤擬谷盜的觸殺作用也強于三叉苦（Evodia lepta）[33]和烏蘞梅（Cayratia japonica）[34]等植物。在本研究中發現揮發油當中的有效成分如4-萜品醇和γ-萜品烯顯示出了較強的抗蟲活性,驗證了之前研究的結果[35-36]，說明連翹揮發油當中的單體化合物對煙草甲和赤擬谷盜具有良好的防治作用。另外，國內外研究表明連翹揮發油當中的桉油精和α-萜品醇對煙草甲具有熏蒸觸殺和驅避活性[37]，莰烯對赤擬谷盜具有良好的觸殺毒性[38]，這些有效成分都有待于進一步開發利用。據文獻報道，連翹揮發油當中的一些成分對其他倉儲害蟲也有一定的防治效果，如對馬鞭草烯酮對玉米象（Sitophilus zeamais）有熏蒸毒殺作用[39]，桃金娘烯醛對德國小蠊（Blattella germanica）有驅避作用等[40]。這些成分也可能對煙草甲和赤擬谷盜具有一定的防治作用，需要在今后的研究中加以證實。

4　結論

本研究分析了連翹果實揮發油的化學成分，評價了揮發油及分離出的單體化合物對煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸和觸殺活性，確定了連翹果實揮發油對這兩種煙草倉儲害蟲的防治作用。雖然作用效果低于陽性對照，但因其作為中藥長期使用，具有較高安全性，并且提取方法簡單，出油率高，資源豐富，仍具有很大開發前景。然而，目前有關連翹果實揮發油及其單體化合物對煙倉害蟲的其他防治作用及作用機理仍需要進一步研究。

[1]黃景崇.廣東煙葉倉儲害蟲發生危害特點及綜合防治[J].廣東農業科學，2007（12）：57-59.

[2]王秀芳，任廣偉，王新偉，等.幾種藥劑對煙草甲生物活性的測定[J].中國煙草科學，2011，32（4）：84-86.

[3]王明潔.對儲煙昆蟲群落及其優勢種煙草甲(Lasioderma serricorne F.)實驗種群的初步研究[D].南京：南京農業大學，1993.

[4]Zettler L J,Keever D W.Phosphine resistance in cigarette beetle(Coleoptera:Anobiidae)associated with tobacco storage in the Southeastern United States[J]. Journal of Economic Entomology,1994,87(3):546-550.

[5]吳厚斌，孫艷萍，劉蘋蘋，等.美國加強磷化鋁和磷化鎂管理[J].農藥科學與管理，2010，31（6）：55-56.

[6]湯朝起，張俊，陸益敏.煙草甲和煙草粉螟的防治研究[J].中國煙草科學，2000，21（4）：46-48.

[7]呂建華，袁良月，吳樹會，等.高良姜根莖粉劑對煙草甲的毒殺作用[J].中國煙草科學，2009，30（2）：62-65.

[8]IsmanM,MiresmailliS,MachialC.Commercial opportunities for pesticides based on plant essential oils inagriculture,industryandconsumerproducts[J]. Phytochemistry Reviews,2011,10(2):197-204.

[9]Regnaultroger C,Vincent C,Arnason J T.Essential oils in insect control:low-risk products in a high-stakes world[J].Annual Review of Entomology,2012,57(1): 405-424.

[10]江志利.植物精油殺蟲作用及制劑研究[D].咸陽：西北農林科技大學，2013.

[11]鐘建軍，呂建華.常用食用油對煙草甲成蟲的觸殺作用[J].中國煙草科學，2012，33（6）：90-92.

[12]楊雪艷，劉成倫.連翹的研究現狀與展望[J].貴州農業科學，2012，40（9）：33-36.

[13]曲歡歡.連翹化學成分和生物活性研究[D].西安：西北大學，2008.

[14]Endo K,Hikino H.Structure of forsythoside C and forsythoside D,antibacterial principles of Forsythia suspensa fruits[J].Heterocycles,1982,19:2033-2036.

[15]Endo K,Takahashi K,Abe T,et al.Structure of forsythoside A,an antibacterial principle of Forsythia suspensa leaves[J].Heterocycles,1981,16:1311-1314.

[16]肖會敏，何悅，王四旺，等.連翹揮發油體外抑菌實驗研究[J].內蒙古中醫藥，2011，30（15）：99-100.

[17]閆麗麗，姜穎.連翹藥材主要化學成分及藥理作用研究綜述[J].中國新技術新產品，2011（11）：11-11.

[18]孟祥樂，李俊平，李丹，等.連翹的化學成分及其藥理活性研究進展[J].中國藥房，2010（4）：4117-4119.

[19]Liu Z L,Ho S H.Bioactivity of the essential oil extracted from Evodia rutaecarpa Hook f.et Thomas against the grain storage insects,Sitophilus zeamais Motsch.and Tribolium castaneum(Herbst)[J].Journal of Stored Products Research,1999,35(4):317-328.

[20]Badiah-Hadj-Ahmed A Y,Meklati B Y,Waton H,et al. Strutural studies in the bicycle[3.1.1]heptane series by 1H and 13C NMR[J].Magnetic Resonance in Chemistry, 1992,30(9):807-816.

[21]Han J H,Kwon Y E,Sohn J,et al.A facile method for the rapid and selective deprotection of methoxymethyl (MOM)ethers[J].Tetrahedron,2010,66(24):1673-1677.

[22]Ishifune M,Yamashita H,Kera Y,et al.Electroreduction of aromatics using magnesium electrodes in aprotic solventscontainingalcoholicprotondonors[J]. Electrochimica Acta,2003,48(17):2405-2409.

[23]Sakuma M.Probit analysis of preference data[J].Applied Entomology and Zoology,1998,33(3):339-348.

[24]Yang K,Wang C F,You C X,et al.Bioactivity of essential oil of Litsea cubeba from China and its main compounds against two stored product insects[J].Journal of Asia-Pacific Entomology,2014,17(3):459-466.

[25]Chen H P,Yang K,You C X,et al.Chemical constituents and biological activities of essential oil from Citrus wilsonii leaves against Tribolium castaneum(Herbst)[J]. Journal of the Serbian Chemical Society,2014,79(10): 1213-1222.

[26]孔杰，姚健，達文燕，等.連翹揮發油化學成分的研究[J].西北師范大學學報：自然科學版，2001，4（4）：77-81.

[27]段文錄，呂本蓮.豫產連翹揮發油化學成分研究[J].安徽農業科學，2008，36（19）：7963-7964.

[28]徐坤.連翹果實揮發油的分離抑菌研究及固體脂質納米粒的制備[D].西安：西北大學，2012.

[29]王鵬，張忠義，吳惠勤.超臨界CO2萃取連翹揮發油的正交試驗和GC-MS分析[J].分析測試學報，2002，21（4）：34-37.

[30]裴曉麗，張淑蓉，王秀文，等.不同產地連翹中揮發油及其β-蒎烯含量的比較研究[J].藥物分析雜志，2010 （1）：127-129.

[31]Chu S S,Liu Z L,Liu Q Z,et al.Chemical composition and insecticidal activities of the essential oil of the flowering aerial parts of Aster ageratoides[J].Journal of the Serbian Chemical Society,2013,78(2):209-216.

[32]Ebadollahi A,Safaralizadeh M H,Pourmirza A A,et al. Toxicity of essential oil of Agastache Foeniculum(Pursh) Kuntze to Oryzaephilus Surinamensis L.and Lasioderma Serricorne F.[J].Journal of Plant Protection Research, 2010,50(2):215-219.

[33]Jiang C H,Liu Q Z,Du S S,et al.Essential oil composition and insecticidal activity of Evodia lepta (Spreng)Merr.root barks from China against two grain storage insects[J].Journal of Medicinal Plants Research, 2012,6(18):3464-3469.

[34]Liu Z L,Yang K,Huang F,et al.Chemical composition and toxicity of the essential oil of Cayratia japonica against two grain storage insects[J].Journal of Essential Oil Research,2012,24(3):237-240.

[35]Wang Y,You C X,Yang K,et al.Bioactivity of essential oil of Zingiber purpureum Rhizomes and its main compounds against two stored product insects[J].Journal of Economic Entomology,2015,108(3):925-32.

[36]Chen H P,Yang K,You C X,et al.Chemical constituents and biological activities against Tribolium castaneum (Herbst)of the essential oil from Citrus wilsonii leaves[J]. Journal of the Serbian Chemical Society,2014,79(10): 1213-1222.

[37]You C X,Guo S S,Zhang W J,et al.Identification of repellent and insecticidal constituents from Artemisia mongolica essential oil against Lasioderma serricorne[J]. Journal of Chemistry,2015,2015:1-7.

[38]Kim S I,Yoon J S,Jung J W,et al.Toxicity and repellency of origanum essential oil and its components against Tribolium castaneum(Coleoptera:Tenebrionidae) adults[J].Journal of Asia-Pacific Entomology,2010, 13(4):369-373.

[39]Herrera J M,Zunino M P,Dambolena J S,et al.Terpene ketonesasnaturalinsecticidesagainstSitophilus zeamais[J].Industrial Crops and Products,2015,70: 435-442.

[40]Schultz G,Peterson C,Coats J,et al.Natural insect repellents:activityagainstmosquitoesand cockroaches[C]//Natural products for pest management, 226th ACS National Meeting,Anaheim,California,USA, 28 March-1 April 2004,2006.

Insecticidal Activities of the Forsythia Suspensa Essential Oil Against Two Tobacco Storage Insects

WU Yan1,GUO Shanshan2,WEI Jianyu1,ZHANG Wenjuan2,BAI Sen1,DENG Binling1, HUANG Dongye1,BAI Jiafeng1,DU Shushan2*
(1.Technical Center of China Tobacco Guangxi Industrial Co.,Ltd.,Nanning 530001,China;2.Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Protection and Utilization,Beijing Normal University,Beijing 100875,China)

Bioactivity screening was conducted in order to develop new botanical pesticides against tobacco storage pests.The essential oil obtained from the fruits of Forsythia suspensa was investigated by GC-MS.A total of 18 components representing 94.30%of the oil were identified and the main compounds in the oil were found to be α-pinene(63.72%),b-terpinyl acetate(7.47%), 4-terpineol(6.67%),3-isopropyltoluene(3.54%)and γ-terpinene(2.54%).It was found that the essential oil exhibited strong fumigant toxicity against Lasioderma serricorne and Tribolium castaneum adults with LC50values of 8.94 and 7.68 mg/L air. Meanwhile,the essential oil exhibited contact toxicity against T.castaneum and L.serricorne adults with LD50values of 23.66 and 30.13μg/adult.Among the three individual compounds,4-Terpineol showed the strongest fumigant and contact activities(LC50= 6.90 mg/L;LD50=8.62μg/adult)against L.serricorne.Meanwhile,α-pinene,γ-terpinene and 4-terpineol exhibited strong bioactivities against T.castaneum.The results indicated that the essential oil of F.suspensa and its isolated compounds have the potential to be developed into natural insecticides for controlling insects in stored tobacco.

tobacco storage;Forsythia suspense;essential oil composition;Lasioderma serricorne;Tribolium castaneum

S435.72

1007-5119（2016）03-0067-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.03.012

廣西科學研究與技術開發計劃課題“廣西特色植物提取物防治煙葉倉儲蟲害的應用研究及機理分析”（桂科攻15118004）；北京市自然基金“竹葉花椒防治藥材倉儲害蟲活性物質基礎及作用機理研究”（7142093）

吳彥（1972-），博士，副研究員，主要從事天然植物在卷煙減害增香中的應用研究及藥理學研究。E-mail：abelabel@126.com*通信作者，E-mail：dushushan@bnu.edu.cn

2015-11-24

2016-03-24