醛固酮受體拮抗劑聯合甘草酸二銨對大鼠肝纖維化進程的影響①

劉艷麗，艾迎春

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

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醛固酮受體拮抗劑聯合甘草酸二銨對大鼠肝纖維化進程的影響①

劉艷麗，艾迎春

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：利用醛固酮受體拮抗劑聯合甘草酸二銨干預肝纖維化大鼠并檢測血清中透明質酸(hyaluronic acid, HA)和血管緊張素1-7(angiotensin (1-7) ,Ang(1-7))的變化，探討聯合用藥對大鼠肝纖維化進程的影響。方法：40只健康雄性SD大鼠用完全隨機的方法，隨機分成5組：正常對照組、模型組、螺內酯+甘草酸二銨聯合治療組、甘草酸二銨治療組、螺內酯治療組。于20、40、60d分別取血，并于60d處死全部SD大鼠，取肝組織做切片處理，HE染色，鏡下觀察比較各組大鼠肝臟組織結構變化。采用ELISA法測定各組大鼠大鼠血清HA和Ang(1-7)水平的變化。采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差±s)表示。組間比較釆用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行統計分析，多重比較采用LSD-t檢驗(方差齊)，或釆用Dunnett -t檢驗(方差不齊)，P<0.05為有統計學意義。結果：與正常對照組比較，20、40、60d各組HA及Ang(1-7)水平均升高(P<0.05)，且呈逐漸升高趨勢，而與模型組比較，藥物治療組HA水平降低(P<0.05)，但Ang(1-7)水平升高(P<0.05),聯合治療組HA水平更低、Ang(1-7)水平更高。甘草酸二銨治療組和螺內酯治療組組間比較無明顯差異(P>0.05)。結論：醛固酮受體拮抗劑聯合甘草酸二銨對大鼠肝纖維化進程有治療作用，隨肝纖維化進展，血清Ang(1-7)水平升高，且藥物治療后其水平升高更明顯，提示Ang(1-7)參與肝纖維化發生發展過程。

關鍵詞：肝纖維化；醛固酮受體拮抗劑；血管緊張素1-7

肝纖維化不是一個獨立的疾病，它是各種致病因子長期損傷肝組織而致慢性肝病的共同病理過程，同時也是肝臟對各種損傷的一種愈合反應，是慢性肝病發展成肝硬化的必經階段。肝纖維化以竇周間隙大量細胞外基質沉積所致的肝內結締組織增生為特點。透明質酸由肝星狀細胞合成的一種糖胺多糖，研究顯示HA是目前診斷肝硬化最敏感標志物。以往人們認為腎素-血管緊張素系統(renin angiotensin system，RAS)具有促纖維化作用。近些年，ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸引起人們的關注，研究發現其為ACE-AngⅡ-AT1的反向調節軸，具有改善纖維化作用，兩軸相互制約。Ang(1-7)是ACE2-Ang(1-7)-Mas的主要活性物質，對纖維化具有保護作用[1,2]。中藥治療肝纖維化已成為目前研究的主要方向[3]。甘草是一味中藥，甘草酸是其最重要成分之一，具有保肝和穩定細胞膜、抗氧化、抗炎、抗過敏、抗潰瘍、免疫調節、抗病毒、抗癌等作用[4]。

臨床上螺內酯作為保鉀利尿劑對肝硬化肝硬化失代償出現腹水并發癥療效確切，螺內酯同時又是RAS中的醛固酮受體拮抗劑，是否可以應用于肝纖維化早期，臨床上對此研究較少，本實驗通過40%CCl4誘導大鼠肝纖維化模型，于20、40、60d分別取血，螺內酯聯合甘草酸二銨干預觀察大鼠肝纖維化指標HA及Ang(1-7)水平變化，并于實驗結束取肝組織行HE染色，觀察各組大鼠肝臟結構變化，進一步闡述RAS和肝纖維化的關系，觀察Ang(1-7)在大鼠肝纖維化進程中的變化，進而觀察醛固酮受體拮抗劑聯合甘草酸二銨對大鼠肝纖維化進程是否有延緩作用，并探討其是否可以作為肝纖維化的一項檢測指標。

1材料與方法

1.1實驗材料

雄性SD大鼠(200±10)g，購自佳木斯大學實驗動物中心；飼料由佳木斯大學實驗動物中心提供；四氯化碳購自天津大茂化學試劑廠；甘草酸二銨購自正大天晴藥業集團股份有限公司；螺內酯片購自北京中新制藥廠；HA和Ang(1-7)ELISA試劑盒購自上海巍樊生物有限公司。

1.2實驗動物分組

40只4～6周齡SD雄性大鼠, 體重(200±10)g，稱重后按體重大小依次編為1，2，3，…，40號，用完全隨機的方法，隨機分成五組：正常對照組、模型組、甘草酸二銨治療組、螺內酯治療組、螺內酯+甘草酸二銨聯合治療組，每組8只。

1.3實驗方法1.3.1肝纖維化大鼠模型制備

SD大鼠適應性飼養一周。正常對照組皮下注射玉米油，3mL/kg，首次5mL/kg；其余各組動物均進行肝纖維化模型制備: 以40%四氯化碳CCl4(CCl4:玉米油=1:4)，皮下注射 3mL/kg，首次5mL/kg，2次/周，共60d。

1.3.2給藥治療

在制備模型的同時，甘草酸二銨治療組、螺內酯治療組和聯合治療組均灌胃給藥，甘草酸二銨60mg/kg，螺內酯每日按100mg/kg，制成1mL溶液灌胃，1次/天，共60d，正常對照組和模型組均予等體積生理鹽水灌胃。

1.4標本采集及指標檢測

分別于20、40、60d眼眶取血，雙抗體夾心酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)測血清纖維化指標HA及Ang-(1-7)，按試劑盒說明書操作。于實驗結束處死全部SD大鼠，10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射進行麻醉，消毒后固定，沿腹部正中剪開皮膚，取肝組織清洗，將部分肝右葉于10%的中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，切片，常規脫蠟，進行HE染色。光鏡下觀察比較各組大鼠肝臟組織結構變化。動物尸體按實驗動物中心要求處理。

1.5統計學方法

2結果

除模型組大鼠于第7、8周各死亡1只，其余大鼠無皮下膿腫，無舔咬自噬均進入實驗結果分析。一般情況：正常組大鼠一般情況良好，食欲好，毛色光亮，體重增加較快，體重持續增加，無死亡。模型組大鼠厭食，毛色晦暗，消瘦，尿色加深，死亡2只，體重增加緩慢，6周后體重無明顯增加。與模型組比較，藥物治療組大鼠食欲尚可，毛色較好，體重增加較慢，無死亡。

2.1HA的變化

與正常對照組比較，模型組HA水平升高(P<0.05)，并呈逐漸上升趨勢。與模型組比較，藥物治療組HA水平降低，聯合治療組降低程度最大(P<0.05)。甘草酸二銨較螺內酯組HA降低，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血清HA檢測結果

注：※P<0.05，與正常對照組相比較;☆P<0.05，與模型組相比較;#P<0.05，與聯合治療組相比較，模型組60d(n=6)。

2.2Ang(1-7)的變化

較正常對照組，各組Ang-(1-7)水平均升高(P<0.05)，并呈逐漸上升趨勢。藥物治療組Ang-(1-7)水平較模型組升高，差異有統計學意義。聯合治療組較螺內酯組或甘草酸二銨組Ang-(1-7)水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。甘草酸二銨組較螺內酯組Ang-(1-7)水平升高，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3大體標本

模型組與正常對照組比較，肝組織表面光亮度減低，邊緣不規整，顏色暗紅，質脆，表面可見小顆粒狀結節，呈橘皮樣。藥物治療組的肝組織色澤、質地、表面光滑度較肝纖維化組均有明顯改善，以聯合治療組為著。

2.4組織形態學改變

HE染色正常對照組大鼠肝細胞形態規整，以中央靜脈為中心呈放射狀規則排列，肝小葉結構正常，無變性壞死，肝索排列整齊，幾乎見不到成纖維細胞，未見炎細胞浸潤；模型組大鼠肝細胞排列紊亂，一些細胞呈空泡狀脂肪變性，胞質疏松，伴匯管區炎細胞浸潤，肝細胞再生明顯，肝索及肝小葉結構紊亂失去正常結構，匯管區擴大見膠原沉積，肝小葉內見纖維間隔形成，部分切片見假小葉及結節形成。與模型組比較，給藥組，肝組織纖維化程度減輕，匯管區擴大，大部分小葉結構清晰，少量纖維間隔形成，未見假小葉，其中以聯合治療組纖維化程度減輕最明顯,見圖1。

表2　各組大鼠血清Ang(1-7)檢測結果

注：※P<0.05，與正常對照組相比較；☆P<0.05;與模型組相比較;#P<0.05，與聯合治療組相比較，模型組60d(n=6)。

圖1　各組大鼠肝臟HE染色結果

3討論

目前肝纖維化治療仍是醫學一大難題，臨床上尚無有效藥物可有效控制或逆轉肝纖維化。甘草酸在臨床上對肝損傷及纖維化有治療作用，螺內酯作為RAS成分用于肝纖維化治療，二者聯合治療在臨床上研究較少。甘草酸二銨具有糖皮質激素樣作用[5]，具有抗炎抗氧化作用，可以減輕炎細胞浸潤，改善炎癥反應減少膠原成分及細胞外基質沉積，延緩纖維化進展。甘草酸二銨與醛固酮的類固醇環結構類似，螺內酯結構也與醛固酮相似，競爭性結合受體，可發揮類固醇樣作用，但不會有激素的相關不良反應[6]。不同的動物體內外實驗證實甘草酸對CCl4誘導的急慢性肝損傷及肝纖維化有明顯的改善作用，甘草酸還可促進肝組織再生和修復能力。李旭等研究發現肝纖維化時肝臟肝星狀細胞編碼醛固酮合成關鍵酶的基因CYPⅡB2表達上調[7]，該試驗顯示二者聯合治療較單藥治療肝纖維化程度減輕明顯。

以往認為RAS具有促纖維化作用。局部RAS主要與組織重構和纖維化有關。肝纖維化過程中，CY P IIB基因明顯上調。局部ALD合成也受RAS調節。曾認為醛固酮主要作用于腎臟遠曲小管，起到保鈉排鉀作用，自20世紀末研究發現一些腎上腺外組織同樣能合成分泌ALD，是一種促纖維化因子。螺內酯為醛固酮受體拮抗劑，既能抑制肝纖維化形成又能抑制肝竇血管生成，通過與醛固酮競爭性結合受體，可以拮抗醛固酮的促纖維化過程。鄭善英等發現在慢性肝炎和肝硬化患者，血漿中AT-Ⅱ和醛固酮均有升高[8]。近些年，ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸引起人們的關注，研究發現其為ACE-AngⅡ-AT1的反向調節軸，具有改善纖維化作用。Ang(1-7)與Mas受體結合，抑制HSCs活化，拮抗ACE-AngⅡ-AT1的促纖維化作用，可產生擴張血管、降低血壓、抗細胞增殖、抗纖維化、調節水鈉代謝等作用，該軸在人類慢性肝損傷和BLD大鼠肝臟明顯上調[9]。研究發現丙肝患者，隨著纖維化進展血漿Ang-(1-7)濃度增加，且呈正相關[10～12]。

在缺乏活組織病理檢查的條件下，肝血清學指標可以作為評價肝纖維化的方法。透明質酸由肝星狀細胞產生的一種糖胺多糖，經淋巴道入血，后隨血液循環到達肝臟，與肝竇內皮細胞受體結合，被胞漿內透明質酸酶分解。肝纖維化時，肝竇毛細血管化，內皮細胞功能受損，間質合成HA增多，而HA分解減少，使血清中HA水平升高[13]。研究顯示HA是目前診斷肝硬化最敏感標志物，是目前臨床上常規肝纖維化檢測指標，可以反映肝纖維化程度。在早期HA升高時Ang-(1-7)即升高，藥物治療組升高顯著，提示其與肝臟受到損傷后自身啟動修復程序有關，對肝纖維化有保護作用，通過對其動態觀察，可作為肝纖維化的一項早期檢測指標，結合其他無創檢測指標診斷早期肝纖維化。為肝纖維化無創檢查提供了理論支持，具有積極的臨床意義。

該實驗觀察60d，病理切片提示肝臟假小葉形成，沒有出現腹水等并發癥，并未到肝硬化晚期階段，因此對于晚期肝硬化該指標的變化還缺乏進一步研究。該實驗是檢測循環血血清學指標，缺乏對局部組織該指標的對照，檢測局部組織需處死動物，無法實施對個體的連續性觀察，另外，從臨床可行性方面來講，檢測局部組織成分也存在困難，只能通過外周血指標變化，反應局部組織學變化。

參考文獻：

[1]孫麗萍, 霍麗娟. 纈沙坦對肝纖維化大鼠ACE2、AngⅡ、Ang(1-7)的影響[J]. 國際消化病雜志,2013,33 (2): 128-131+141

[2]Zhang W, Miao J, Li P, et al. Up-regulation of components of the renin-angiotensin system in liver fibrosis in the rat induced by CCl4[J]. Res Vet Sci,2013,95 (1): 54-58

[3]艾迎春，車立昱. 參芎治療肝纖維化的實驗研究[J]. 黑龍江醫藥科學,2013,35 (2):107-108

[4]夏海珊，陳少茹. 肝纖維化的發病機制和藥物治療現況[J].中國醫藥導報,2014,11 (18)：162-165,168

[5]賀延新，趙清喜. 異甘草酸鎂聯合熊去氧膽酸治療自身免疫性肝炎肝硬化失代償期的療效觀察 [J]. 黑龍江醫藥科學,2012,35 (2):11-12

[6]王磊. 甘草酸二胺對特發性肺間質纖維化血清透明質酸及Ⅲ型前膠原的影響[J]. 實用心腦肺血管病雜志,2012,20 (4): 641-642

[7]李旭. 肝星狀細胞表達醛固酮合成酶基因及安體舒通抗肝纖維化的研究[J]. 中華肝臟病雜志,2001,9 (2): 75-77

[8]鄭善英，周艷春. 醛固酮和血管緊張素Ⅱ在肝硬化腹水患者血清中變化的探討[J]. 中國醫學創新,2010,7 (30):66-67

[9]Herath CB, Warner FJ, Lubel JS, et al. Upregulation of hepatic angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and angiotensin-(1-7) levels in experimental biliary fibrosis[J]. J Hepatol,2007,47 (3): 387-395

[10]武淑君, 霍麗娟. 大鼠肝纖維化形成過程中血管緊張素轉化酶2-血管緊張素(1-7)-Mas受體的動態變化情況[J]. 中華肝臟病雜志,2014,22 (2):118-121

[11]GRACE JA. Update on new aspects of the renin-angiotensin system in liver disease: clinical implications and new therapeutic options[J]. Clin Sci (Lond),2012，(19)：225-239

[12]Huang ML, Li X, Meng Y, et al. Upregulation of angiotensin-converting enzyme (ACE) 2 in hepatic fibrosis by ACE inhibitors[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol,2010,37 (1): 1-6

[13]馬玉娜. 肝纖維化臨床檢驗血清學檢測指標的研究[J]. 中華高血壓雜志,2014,22 (2):179

基金項目:①佳木斯大學研究生科技創新項目，編號：LM2015_043。

作者簡介:劉艷麗(1988～) 女，河北承德人，在讀碩士研究生。 通訊作者:艾迎春(1960～) 女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail: haiyan7416_ncmc@163.com。

中圖分類號：R575.2

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)04-0022-04

(收稿日期：2015-10-13)

The influence and clinic significance of aldosterone acceptor antagon associate with diammonium glycyrrhizinate on the proceeding of rat hepatic fibrosis

LIUYan-li,AIYing-chun

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Abstract:Objective: To intervene rat hepatic fibrosis with aldosterone acceptor antagon association with diammonium glycyrrhizinate; and to detect the changes of hyaluronic acid (HA) and angiotensin (1-7) (Ang(1-7)) level in serum, so as to probe the influence and likely mechanism of treating with association medicine on rat hepatic fibrosis. Methods: 40 male healthy Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into five groups: control group, hepatic fibrosis model group, association treatment group, diammonium glycyrrhizinate treat group, spironolactone treat group. Their blood were taken separately in the 20th, 40th and 60th days. After the 60th day, all SD rats were sacrificed. The liver tissue of all rats were taken, and then made paraffin section and HE staining. The changing differences of the rats’ liver tissue in each group were observed by microscope and compared. The serum HA and Ang(1-7) levels were tested by ELISA. All statistical analysis were performed with SPSS17.0, and shown by mean±standard ±s). The intergroup comparison were taken by One-way ANOVA. Multiple comparison were taken by LSD-t test or Dunnett -t test. It is considered statistical significance when P is less than 0.05. Results: Compared with the normal control group, the HA and Ang(1-7) levels in each group are step up in the 20th, 40th and the 60th days, and has the gradually step up tendency. While compared with the model group, the HA level in the drug treatment groups were decreased(P<0.05), but the Ang(1-7) levels were increased(P<0.05). In association treatment group, there are less levels of HA, and higher Ang(1-7) levels. The comparasion between diammonium glycyrrhizinate treat group and spironolactone treat group has no significant difference. Conclusion: Aldosterone acceptor antagon associate with diammonium glycyrrhizinate can daly the proceeding of rat hepatic fibrosis. As the development of hepatic fibrosis, the serum Ang(1-7) levels increase, and after the drug treatment the increasing is more significant, which suggests that Ang(1-7) is involed in the development of rat hepatic fibrosis, and it may be a protective indel during liver fibrosis.

Key words:hepatic fibrosis; aldosterone acceptor antagon; Ang(1-7)