不同光量子數藍光對豚鼠視網膜超微結構的影響①

徐志剛，呂淑慧，楊笑天，張　滌，王玉清

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

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不同光量子數藍光對豚鼠視網膜超微結構的影響①

徐志剛，呂淑慧，楊笑天，張滌，王玉清

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：研究不同光量子數藍光長期間斷照射對豚鼠視網膜組織超微結構的影響。方法：將42只普通級英國短毛三色健康雄性豚鼠隨即分成A、B、C、D、E、F組，給予不同強度的藍光照射，光量子數分別為3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、12.0μmol·m-2·s-1，20周后對各組豚鼠視網膜組織損傷情況進行電鏡檢測。結果：各組豚鼠視網膜組織均出現一定程度的超微結構改變，光感受器細胞變性、凋亡速度加快，如萎縮、變薄、溶解、斷裂、凝固、空泡增多等，但并未發現某一組的損傷明顯重于其他組的情況，也未觀察到對藍光吸收最強的視網膜光感受器細胞損傷程度明顯高于其他層面的情況。結論：光量子數低于12μmol·m-2·s-1的藍光長期間斷照射對豚鼠的眼部發育是相對安全的，所造成的輕微損傷可能與幼齡豚鼠視網膜發育不健全有關。

關鍵詞：藍光；電鏡；視網膜；損傷

我國近視發病的最新資料，青少年近視發病率呈逐年上升趨勢，小學生近視發病率平均為50%,高三學生近視發病率平均為90%[1]。近年來，針對藍光照射可抑制“正視化”進程的研究已成為眼科領域的熱點，越來越多的實驗數據也證實藍光照射可減緩近視的發生及發展[2]。與此同時，藍光長時間照射對視網膜損傷作用也引起了人們的關注，藍光對視網膜組織敏感性最高、穿透力最強、損傷作用最明顯[2,3]。因此，在將藍光應用于近視預防的過程中，如選擇對視網膜組織安全、有效的藍光照射光量子數具有重要的臨床意義。本實驗應用不同光量子數的的藍光作為光源，對豚鼠進行間斷照射，而后對各組豚鼠的視網膜組織進行電鏡觀察，期待獲得對視網膜組織損傷最小的藍光照射光量子數或大致范圍，給進一步研究藍光對青少年近視發生發展的抑制作用提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組：普通級英國短毛三色健康豚鼠42只，體質量90～110g，鼠齡2周，雄性(長春市億斯實驗動物技術有限責任公司)。選取屈光間質透明度好，無明顯眼疾個體，采用隨機數字表法將豚鼠分為6組，分別為A、B、C、D、E、F組，應用不同光量子數的藍色光進行照射。

1.1.2儀器：JEM-1200EX型透射電鏡(日本電子株式會社)；CM1950型超薄冰凍切片機(德國徠卡公司)；Lumera T型手術顯微鏡(德國卡爾·蔡司公司)；手術器械(蘇州六六醫療器械廠)；藍光LED燈管(蘇州久騰光電科技有限公司)，藍色LED燈光波峰值為430nm(半波寬為30)；CX-T02型可編程多功能電子定時器(常熟常新電子有限公司)。

1.2方法

1.2.1光照條件設定：光量子數是目前光照實驗國際通用的作用標準，選取人眼能夠接受的光量子數量來設計實驗環境，更利于后期開展臨床試驗。A、B、C、D、E、F組照射的光量子數分別為3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、12.0μmol·m-2·s-1(見圖1)。將定時器串聯在主線上，調整至12h/12h，每隔12小時自行開關，使每組接受的光照時間一致。

1.2.2光照20周后每組選取2只發育較好的豚鼠，經水合氯醛麻醉后，迅速摘除眼球，在進口顯微鏡下，沿睫狀體平坦部剖開，緩慢去除玻璃體，仔細分離出視網膜組織，平鋪于濾紙上，均選取近黃斑區處，切取1. 5mm×3. 0mm長方形小塊，PBS漂洗后置于4%戊二醛中前固定4℃過夜，1%鋨酸后固定2h，乙醇-丙酮梯度脫水，環氧樹脂618包埋劑定向包埋，半薄切片光學顯微鏡下定位，制成超薄切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染法染色，JEM-1200EX 80KV透射電鏡觀察、攝片。

2結果

光照20周后，各組豚鼠視網膜組織均出現或多或少的超微結構改變，光感受器細胞變性、凋亡速度加快，如萎縮、變薄、溶解、斷裂、凝固、空泡增多等。A組內核層細胞漿水腫樣變性，核周圍間隙增寬，核內染色質凝聚，核仁明顯溶解，證實細胞發生了凋亡(見圖2)；B組內網層細胞漿內含有大量變性的細胞器，細胞膜破裂，細胞器外溢，超微結構特征不易辨認(見圖3)；C組外節膜盤排列清晰規則,分界明顯，局部水腫、膜盤增寬、間隙增大，失去正常的板層結構，病變嚴重處膜盤溶解，相互融合，界限分辨不清(見圖4)；D組外核層細胞核明顯固縮，核內染色質凝聚，核膜消失(見圖5)；E組外節盤膜局部斷裂溶解，出現不規則缺損，即“蟲咬現象”(見圖6)；F組節細胞層細胞空泡化損害，細胞膜局部凹陷、破裂，細胞核溶解，呈新月形邊集，細胞器明顯減少(見圖7)。

圖1各組光照場景。 圖2A組內核層細胞核周圍間隙明顯增寬，細胞核溶解(×2000)。圖3B組內網層細胞內出現大量的變性細胞(×2000)。圖4C組外節膜盤局部溶解，相互融合(×2000)。圖5D組內核層細胞核固縮明顯，核膜消失(×2000)。圖6E組外節盤膜發生不規則缺損，即“蟲咬現象”(×2000)。圖7F組節細胞細胞膜局部凹陷、破裂，細胞核溶解，呈新月形邊集(×2000)。

3討論

本研究選取三色豚鼠作為研究對象，性格溫順，易于檢查，獲得數據更準確。豚鼠為二色視動物，視網膜組織存在兩種視錐細胞，對藍光、綠光敏感，并含有黑色素，這些結構與人類相似[4]。人類的視網膜感光細胞含有3種視色素，分別對紅、綠、藍三種顏色光敏感[5]；黑色素主要分布在RPE細胞(黃斑區較多)、睫狀體、虹膜以及脈絡膜的色素細胞中。黑色素有穩定自由基、防止高能量短波長光引起潛在光毒性、防止光化學損傷等作用。同時，選取430nm的藍光作為照射光源，與往常光損傷的實驗研究所采用廣譜藍光(400～500nm)相符[6]，具有較好的可比性。所以，實驗結果可為開展藍光抑制青少年近視發生發展的臨床試驗研究提供重要參考依據。

隨著對藍光認識的逐漸加深，可以明確藍光在視網膜產生圖形和色覺的感知和分辨能力，調節生物體內激素分泌，治療新生兒黃疸，保持動物的晝夜節律，抑制“正視化”進程等方面都發揮著重要積極作用[7～9]。然而，伴隨藍光日益廣泛的應用，對藍光的安全性研究顯得格外重要，光化學損傷是光輻射對視網膜細胞和RPE細胞的所造成的主要病變之一。雖然有多個動物實驗及體外細胞培養的實驗證明了暴露于高強度藍光后所引起的視網膜組織的光損傷[10～12]，損傷程度與以下多種因素有關，如光譜范圍、光量子數、光照持續時間、物種視網膜的組織結構特點等，但長期、慢性、低強度的藍光輻照是否可對人眼的產生損傷及損傷程度尚未得到證明，本實驗結果可彌補這方面的不足。

本課題組已完成并報道的研究中：利用不同光量子數藍光間斷照射20周后，可明顯抑制豚鼠的“正視化”發展，觀察豚鼠視網膜結構改變(Tunel染色)，各組視網膜組織均出現了一定程度的細胞凋亡，光感受器細胞核凋亡數量略多。視網膜神經節細胞核、雙極細胞層及光感受器細胞層均可見未染色、染色質濃縮邊緣化、核膜裂解、凋亡小體等凋亡細胞。視網膜高倍鏡(×400)視野下凋亡細胞數量，平均約為(6.68±1.78)個，不同光量子數藍光照射下差異無統計學意義(P>0.05)。

本研究通過電鏡檢測對各組豚鼠視網膜超微結構改變進行比較，可以了解藍光照射后豚鼠視網膜組織，尤其是黃斑區感光細胞的細微損傷，對視網膜HE染色檢測和Tunel細胞凋亡檢測是一個很好的補充。每組標本通過多層面電鏡檢查，對視網膜內核層、內網狀層、節細胞層、感光細胞外節膜盤等組織進行詳細觀察(圖2～7)，經過仔細對比后發現，各組視網膜各層面均可發現輕微程度的病理損傷，可觀察到如細胞水腫、變性、萎縮、核周間隙增寬，外節膜盤局部溶解、融合(蟲咬現象)等，但并未發現某一組的損傷明顯重于其他組的情況，也未觀察到對藍光吸收最強的視網膜光感受器細胞損傷程度明顯高于其他層面的情況，這種損傷的存在可能與視網膜細胞“衰老”關系密切。由此可見，光量子數低于12μmol·m-2·s-1的藍光長期間斷照射并未給正常發育中的豚鼠視網膜感光細胞(黃斑區)造成過多的損傷，與前期研究結果相符。

這種損傷也可能與2W齡豚鼠視網膜發育不健全有關, 其視網膜的防御機制尚未發育完全，角膜及晶狀體是抵御光視網膜病變的屏障作用尚未完善，視網膜自身抵御光毒性的防御機制尚未形成。所以，日常生活中，嬰幼兒也應加強對于強度過高的可見光及短波長藍光的防護，在此期采取類似藍光照射的治療措施應該慎重，并做好相應的保護措施。同時家長應該督促孩子避免長時間的近距離用眼，多進行遠眺和參加室外活動[13]。

綜上所述，光量子數低于12μmol·m-2·s-1的藍光照射對幼年豚鼠的眼部發育是相對安全的，并未表現出光照強度越大損傷越重的一般性規律。依據本研究結果可提出一種假設，這種損傷的發生可能與幼齡豚鼠視網膜發育不健全有關，但具體情況尚需進一步的研究加以證實。

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基金項目：① 1.佳木斯大學重點課題，編號：Sz2013-007；2.黑龍江省衛生廳科研項目，編號：2013251。

作者簡介：徐志剛(1976～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫師。 通訊作者：王玉清(1966～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，教授，碩士研究生導師。E-mail:468069508@qq.com。

中圖分類號：R774

文獻標識碼：B

文章編號：1008-0104(2016)04-0086-03

(收稿日期：2016-01-20)