左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織網格蛋白和dnmⅠ的表達影響①

羅小華，王　影，潘曉華，畢艷旭，王淑靜，王　禹，韓小唯

(佳木斯大學附屬第一醫院兒內二科，黑龍江 佳木斯 154003)

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左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織網格蛋白和dnmⅠ的表達影響①

羅小華，王影，潘曉華，畢艷旭，王淑靜，王禹，韓小唯

(佳木斯大學附屬第一醫院兒內二科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：通過氯化鋰—匹羅卡品(Li-pilo)致癇大鼠模型，探討左乙拉西坦對大鼠海馬組織網格蛋白和dnmⅠ的表達影響。方法：隨機將健康Wistar雄性4周齡大鼠96只，分為生理鹽水組，左乙拉西坦組，癲癇模型組，治療組，共4組，每組24只。用Li-pilo給大鼠造模，然后第1、2、4周斷頭取四組腦組織，用免疫組化檢測海馬組織網格蛋白和dnmⅠ的表達。結果：用Li-pilo組均出現癲癇發作。網格蛋白和dnmⅠ的表達量，左乙拉西坦組與生理鹽水組相比無差異，治療組、癲癇模型組與生理鹽水組相比表達量明顯增強，治療組與癲癇模型組相比表達量明顯減少。結論：用Li-pilo組網格蛋白和dnmⅠ的表達水平明顯增強，左乙拉西坦治療癲癇效果明顯，可能與它能減少癲癇大鼠海馬組織中網格蛋白和dnmⅠ的表達有關。

關鍵詞：左乙拉西坦；癲癇；網格蛋白；dnmⅠ；大鼠海馬

癲癇是一種常見、反復因大腦神經元突發異常放電而發作、病因復雜的神經系統綜合癥，具體發病機制還不明確，是一種慢性的短暫的大腦功能障礙疾病。兒童神經系統發育未成熟，易發生癲癇，據國內多次大樣本調查，60%癲癇患者起源于小兒時期，長期發作會導致腦損傷甚至持久神經精神障礙。經常癲癇使大腦神經元受損、突觸重建容易異位和突觸聯系容易中止，嚴重影響腦的正常發育[1]。左乙拉西坦(Levetiracetam,LEV)是毗咯烷類具有全新抗癲癇作用的新型藥物，治療各種癲癇效果好，其主要可能是與突觸囊泡蛋白2A結合發揮抗癲癇作用[2]。通過突觸區神經遞質釋放，使神經元間信號傳遞，其中突觸囊泡循環是神經元遞質傳遞核心。Dynamin-Ⅰ，又稱發動蛋白Ⅰ，即dnm1是一種突觸前膜蛋白，只在腦、神經內分泌細胞及神經元突觸連接部位中特異性表達，主要參與囊泡從細胞膜到細胞漿的內吞。dynamin-Ⅰ主要用處是接受各種調控后，聚集在囊泡頸部成環，此囊泡頸部被網格蛋白包裹內陷，然后GTP水解調節收縮，使囊泡與突觸前膜分離，從而使胞吞過程完成[3]。網格蛋白是蛋白質復合體，由一條重鏈蛋白和一條與重鏈蛋白緊密伴隨的輕鏈蛋白組成，對囊泡循環再生起關鍵作用。網格蛋白先招募后解離，分為[4]：開始招募銜接蛋白和網格蛋白；包被小凹內陷縊裂及液泡芽殖；包被液泡脫殼三個過程。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組

將96只健康Wistar大鼠(大連醫科大學實驗動物中心提供)，隨機分四組： LEV組(左乙拉西坦組24只)，NS組(生理鹽水組24只)，Li-pilo組(癲癇模型組24只)，Li-pilo+ LEV組(左乙拉西坦治療組24只)，實驗起始體重約為(200±20)g。

主要試劑：匹羅卡品和氯化鋰(美國西格瑪公司)、左乙拉西坦(比利時UCB.Pharma S.A.公司,批號：48167)、網格蛋白抗體和dnm1抗體(北京博奧森生物技術有限公司)、多聚甲醛(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

①根據文獻[5]建動物模型，測大鼠體重，治療組、癲癇模型組先腹腔注射氯化鋰125mg/kg，21h后給東莨菪堿1.6mg/kg，30min后注射匹羅卡品80mg/kg。觀察大鼠行為，凡連續出現3次Ⅲ～Ⅴ級發作者造模成功，癲癇發作程度按Racine標準：0級：沒有抽搐；I級：面、耳抽動；Ⅱ級：節律性點頭；Ⅲ級：前肢震顫；Ⅳ級：前肢伸值伴身體立起；Ⅴ級：跌倒和全身陣攣。造模成功一直抽搐30min后，立即注射地西泮10mg/kg，使發作停止。造模成功24h后，治療組和左乙拉西坦組每天灌胃左乙拉西坦200mg/kg，生理鹽水組及癲癇模型組每天灌胃等劑量生理鹽水，連續4周動態觀察，并分別于第1、2、4周取四組海馬組織(用多聚甲醛保存)用于實驗。

②用免疫組化檢測網格蛋白和dnm1的表達水平 分別于li-pilo或生理鹽水注射前，注射后1W、2W、4W對著大鼠，用多聚甲醛給左心灌注，接著取海馬組織，然后放入4%多聚甲醛，使其固定海馬組織30min以上，最后用4℃冰箱保存備用。海馬組織固定48h后切成2mm厚組織塊；進行梯度乙醇脫水；二甲苯透明:二甲苯Ⅰ25min、二甲苯Ⅱ20min；浸蠟:石蠟Ⅰ熔點 52～54℃/40min、石蠟 II熔點 56～58℃/1h；包埋：石蠟Ⅲ熔點 60～61℃，包埋后輪轉式切片機切厚4μm片，56℃/4h烘干作為備用。進行免疫組化，顯微鏡下發現棕黃色顆粒時，把顯色反應停止，再次用酒精脫水和二甲苯透明，最后樹膠封片、鏡下觀察、照相[6]。

1.3統計學方法

表示，組間差異比較用方差分析，兩兩比較用LSD法，檢驗水準α為0.05有統計學意義。

2結果

2.1動物行為觀察

大鼠癲癇樣的發作在打針pilo大約15min后，行為：點頭，前肢陣攣抽搐，前肢伸直伴有身體立起，跌倒甚至全身驚厥。發作持續抽搐30min后立即注射地西泮終止抽搐。最后左乙拉西坦每天灌胃，結果治療組大鼠癲癇發作漸漸減少。

2.2LEV對網格蛋白和dnm1的表達量

網格蛋白和dnm1的免疫反應產物重點集中在海馬區，各時間段生理鹽水組和左乙拉西坦組dnm1和網格蛋白OD比較，其差異無統計學意義(P>0.05)；各時間段癲癇模型組dnm1和網格蛋白OD與生理鹽水組比較，結果增高，其差異有統計學意義(P<0.05)；各時間段治療組dnm1和網格蛋白OD與癲癇模型組比較，結果降低，其差異有統計學意義(P<0.05)。見表1～2。

表1　各組大鼠網格蛋白OD比較

注:a與NS組比較P<0.05；b與LEV組比較P<0.05；c與Li-pilo組比較P<0.05。

表2　各組大鼠dnm1OD比較

注:a與NS組比較P<0.05；b與LEV組比較P<0.05；c與Li-pilo組比較P<0.05。

3討論

癲癇是比較嚴重神經系統疾病，尤其是難治性癲癇的反復發作給患兒本身帶來了極大的痛苦，長時間的看護與治療也給患兒的家庭帶來了巨大的負擔。癲癇發病機制復雜，主要通過加強突觸囊泡循環使神經元高度同步化激活，導致腦神經元過度異常放電[7]。突觸囊泡循環是神經遞質傳遞的基礎，癲癇患者神經元突觸出問題，它功能明顯異常，通過加強突觸囊泡循環，使突觸傳遞的神經沖動大大增加，從正常情況下數次或數十次每秒立即增加至數十次到數百次每秒，導致癇性放電到處傳播和散開[8]。網格蛋白和dnm1是囊泡循環中兩大重要蛋白。突觸囊泡循環主要包括胞吐、胞吞以及囊泡在細胞內的循環三個過程，其中，囊泡膜內吞回收主要方式是網格蛋白介導的內吞，其在囊泡循環再生中起關鍵作用，并且在囊泡的內吞過程中，需要依賴Dnm1從胞膜上剪切囊泡。Dnm1參與網格蛋白介導的內吞過程，把每個囊泡回收到突觸前終末，使囊泡里面的神經遞質準備下一次釋放，是囊泡再攝取過程中囊泡的必需成分。據相關研究報道，癲癇發作時Dnm1水平均顯著增強[9]，Dnm1的過度表達可能是維持這種異常同步放電的物質基礎。內吞包括網格蛋白依賴及非網格蛋白依賴兩種方式，癲癇突觸囊泡循環再生主要通過網格蛋白依賴內吞，研究發現癲癇發作時網格蛋白表達增強[10]，結果囊泡回收加強，通過突觸擴布，形成異常高頻的癇樣放電，最終導致癲癇臨床發作。

本文通過實驗也證實了這一結果并發現隨著癲癇發作時間延長網格蛋白和Dnm1表達增強越明顯。左乙拉西坦是一種抗癲癇新型藥物，安全性高，不良反應少，幾乎不影響肝腎功能及血液系統，可能與突觸囊泡蛋白2A結合，使神經遞質的釋放受影響，從而抗癲癇。本實驗發現，癲癇大鼠中網格蛋白和Dnm1表達增強，使突觸囊泡循環再生加強，促進囊泡回收，加重癲癇。LEV能很好控制癲癇發作，作用機制之一可能是通過下調海馬區網格蛋白和Dnm1表達發揮其抗癲癇作用。但癲癇發病機制非常復雜，是多因素導致結果，海馬區網格蛋白和Dnm1表達的下調是否是LEV控制癲癇發作的作用機制還需進一步研究。

參考文獻:

[1]馮宏達,王禹,王海燕,等.左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中突出后致密物PSD-95表達的影響[J]. 黑龍江醫藥科學,2014,37(04):63-64

[2]毛詩賢,馮亞梅,楚蘭,等.杏仁核點燃癲癇大鼠模型海馬組織突觸囊泡蛋白2A的表達變化[J].中風與神經疾病雜志,2012,11:1008-1011

[3]Doherty G J, M cM ahonHT. M echan ism s of endocy tos is An-nu R ev Biochem, 2009,78:857-902

[4]姚鵬程,葉恭銀. 網格蛋白介導的內吞作用機制[J]. 生命科學研究,2003,S1:22-25+69

[5]Lynch BA,Lambeng N，Nocka K，et al.The synaptic vesicle protein SV2A is thebinding site for the antiepileptic drug levetiracetam[J].ProcNatlAcad SciU SA，2004，101(26)：9861-9866

[6]裴艷瑩,鄒艷紅,王海燕,等. 左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中CAMKⅡ及NCX3表達的影響[J]. 黑龍江醫藥科學,2015,38(04):31-34

[7]Aarts MM，Tymianski M.Molecular Mechanisms Underlying Specificity of Excitotoxic Signaling in Neurons[J].Curr Mol Med，2004，4(2)：137-147

[8]Schmid E M，Mcmahon H T.Integrating molecular and network biology to decode endocytosis[J].Nature,2007,448(7156):883-888

[9]肖爭. 癲癇突觸機制中發動蛋白、突觸融合蛋白、突觸囊泡膜蛋白及相關蛋白研究[D].重慶醫科大學,2010

[10]龔云,王學峰,汪建華,等. 難治性癲癎患者腦組織突觸囊泡回收相關蛋白的表達[J]. 中華神經科雜志,2006,03:155-158

基金項目：①佳木斯大學研究生科技創新項目，編號：LM2015_016。

作者簡介：羅小華(1986～)男，湖南邵陽人，在讀碩士研究生。 通訊作者：王海燕(1957～)女，黑龍江佳木斯人，學士，主任醫師，教授，碩士研究生導師。E-mail：276137680@qq.com。

中圖分類號：R749.1+7

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)04-0095-02

(收稿日期：2016-01-08)