應用電化學微檢測系統檢測細胞中嘌呤堿基①

高　寒，武榮國，王書紅，張思佳，年　麗，鄔　迪，崔繼文

(佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯154007)

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應用電化學微檢測系統檢測細胞中嘌呤堿基①

高寒，武榮國，王書紅，張思佳，年麗，鄔迪，崔繼文

(佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯154007)

摘要：目的：構建電化學微檢測系統，在電化學檢測中節省細胞樣品，提高檢測效率。方法：以三電極工作系統為基礎，在工作電極上套上微管作為微型反應池，倒置后加入微量待測試溶液，將參比電極和對電極放入溶液中，形成穩定的微反應系統，得到更穩定、更強的電化學信號。結果：僅僅30μL MCF-7細胞即在電化學微檢測系統中出現兩個氧化峰，分別歸因于黃嘌呤/鳥嘌呤和腺嘌呤/次黃嘌呤的氧化還原反應。結論：MCF-7細胞中的嘌呤堿基在電化學微檢測系統中具有較好的電化學響應，該電化學法有可能用于細胞內嘌呤的檢測。

關鍵詞：MCF-7；微檢測系統；MWCNTs-IL/GCE；單線掃描伏安法

近年研究表明細胞內嘌呤堿基具有電化學活性，采用循環伏安法測試能夠得到較好的電化學信號，但基于傳統三電極工作系統的電化學檢測中細胞樣本消耗較大，導致檢測成本升高，從而限制了其進一步應用[1～9]；如果能夠改進檢測體系，降低細胞樣本消耗量，又能得到足夠的電化學響應，可以有效評價細胞活性，將對細胞電化學進一步的應用具有極為重要的意義，故本文以人乳腺腫瘤細胞(MCF-7)為模型細胞，在原三電極體系的基礎上進行了一下巧妙的改裝，設計了一種相對比較簡便、快捷并且十分廉價的微檢測體系，來研究細胞內嘌呤堿基的電化學行為，為拓展細胞電化學的應用領域提供實踐基礎。

1實驗部分

1.1試劑與儀器

電化學工作站，上海辰華儀器有限公司；HH.CP-T型二氧化碳培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；人乳腺腫瘤細胞MCF-7，東北林業大學贈送；次黃嘌呤，黃嘌呤，鳥嘌呤，腺嘌呤，Sigma公司；多壁碳納米管(MWCNTs)，深圳納米港有限公司；離子液體(IL)，J&K Chemical Ltd.；優級胎牛血清、DMEM培養基、雙抗(鏈霉素和青霉素)，Gibco公司；其余試劑均為分析純。

1.2電化學微檢測系統的建立

本實驗通過大膽的構想，設計一種相對比較簡便、快捷并且十分廉價的微電極體系：在原三電極體系的基礎上進行了一下巧妙的改裝，把一個與工作電極粗細相當的塑料管套在工作電極上，然后將工作電極倒立，以玻碳電極的鏡面作為反應池的底，塑料管作為反應池的側壁，用移液槍往反應池中打入待測液，再把參比電極和對電極插入到液面下，即得電化學微檢測系統，該體系僅需30μL待測液即可完成一次電化學檢測。

1.3電化學檢測

本實驗分別采用電化學微檢測系統和常規三電極體系完成電化學測試，其中多壁碳納米管和離子液體復合修飾玻碳電極(MWCNTs-IL/GCE)為工作電極，Ag/AgCl絲為參比電極，Pt絲為輔助電極，采用單線掃描伏安法進行檢測，伏安掃描范圍為0.0～+1.0V，掃速為0.05 V·s-1，通常掃描兩次，一般情況采集第一次的數據。除特殊說明外，測定均在室溫條件下進行，測定前需要在電位+0.0V下富集360 s。每次電化學測定結束后，MWCNTs-IL/GCE均在pH 7.4 PBS溶液中循環伏安掃描5圈，重新得到穩定性和重復性均良好的更新電極。

1.4MCF-7細胞的培養和收集

MCF-7細胞放在DMEM培養液中，于37℃恒溫、5% CO2、100% 飽和濕度培養箱中培養。待細胞長至在培養皿中80%貼壁時，用適量的0.25%胰蛋白酶消化，放入37℃的CO2培養箱中消化至胞質回縮，細胞之間不再連接成片，加適量DMEM培養液，置37℃、5% CO2、100%飽和濕度的培養箱中繼續培養。

將生長狀態良好且長滿培養皿底的細胞依次按0.25% 胰蛋白酶消化、吹打懸浮、離心(1000 r·min-1，10min)后得細胞沉淀，所得細胞沉淀用pH 7.4 PBS溶液沖洗3次，然后用適量的pH 7.4 PBS溶液配成細胞懸液并計數，取一部分細胞懸液在50℃水浴鍋中加熱30min后得到MCF-7細胞裂解液用于電化學測定。

1.5高效液相(HPLC)檢測

將不同濃度細胞裂解液和4種嘌呤標準品混合物進行HPLC檢測，進樣量均為為20μL，色譜條件：Ascenis RP-Amide柱(250mm×4.0mm ID，5.0μm)，DAD檢測器，檢測波長為254nm，流動相為磷酸二氫鉀溶液，pH 4.0，流速為1.0mL·min-1。

2結果與討論

2.1電化學微檢測系統和常規三電極體系對比

圖1是濃度均為5×10-6mol·L-1的次黃嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤和腺嘌呤的混合溶液的單線掃描伏安圖，在電化學微檢測系統和常規三電極體系中檢測均得到兩個電化學信號，分別在0.5936V和0.9216V左右出現兩個信號，前一個信號為鳥嘌呤和黃嘌呤的氧化還原峰，后一個信號為腺嘌呤和次黃嘌呤的氧化還原峰，對比圖1a和1b可知，電化學微檢測系統檢測得到的峰電流變得更強，以上檢測結果表明電化學微檢測系統在消耗較少待測液的情況下，還可以得到較強的電化學響應信號，如果應用于細胞電化學檢測則可以有效節省細胞樣品，提高檢測效率，因此本實驗所建立的電化學微檢測系統具有很高的應用價值。

圖1　電化學微檢測系統和常規三電極體系對比

2.2MCF-7細胞在微反應電極系統上的電化學行為

MCF-7細胞裂解液在電化學微檢測系統和常規三電極體系中的電化學行為如圖2所示，MCF-7細胞裂解液在常規三電極體系中僅在0.5941V處出現一個信號，歸屬于鳥嘌呤和黃嘌呤的氧化還原峰，而在電化學微檢測系統中則分別在0.6230V和0.9587V處出現兩個明顯的電化學信號，分別歸屬于鳥嘌呤/黃嘌呤和 腺嘌呤/次黃嘌呤的氧化還原峰[9]，這個結果表明電化學微檢測系統的電化學檢測敏感性要遠高于常規三電極體系，把它應用到細胞活性與抗癌藥物敏感性，將可以節省大量細胞樣品，從而降低檢測費用，為細胞電化學用于臨床檢測奠定一定的基礎。

圖2　MCF-7細胞裂解液的單線掃描伏安圖

2.3高效液相檢測

本實驗采用高效液相色譜法對細胞中嘌呤類物質進行分析，結果如圖3所示，通過四種混合標準品得到了四個分離良好的液相峰(圖3A)，保留時間分別為：12.53，13.63，15.65，21.41min，依次為次黃嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤和腺嘌呤，說明四種嘌呤類物質能夠很好的分離。圖3B為MCF-7細胞的不同濃度的色譜圖，得到了7個分離良好的色譜峰，其中能確定的四個色譜峰：12.68，13.78，15.88，21.53min與標準品圖中次黃嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤和腺嘌呤的峰位一致，說明MCF-7細胞也存在次黃嘌呤，鳥嘌呤，黃嘌呤和腺嘌呤，由此可以證明把電化學方法檢測的兩個信號歸因于四種嘌呤的氧化還原是正確的。

圖3　不同濃度細胞和四種嘌呤標準品的HPLC圖譜

(A)嘌呤標準品混合物；(B)細胞裂解液(HX：次黃嘌呤，G：鳥嘌呤，X：黃嘌呤，A：腺嘌呤；a：1×106cells mL-1b：7×105cells mL-1c：3×105cells mL-1d：8×104cells mL-1)

3討論

我們采用工作電極上套上微管作為微型反應池，并把參比電極和對電極集成在一起構建了電化學微檢測系統，僅僅消耗30μL MCF-7細胞樣本即在電化學微檢測系統中得到分別歸屬于黃嘌呤/鳥嘌呤和腺嘌呤/次黃嘌呤的氧化還原峰，結果表明MCF-7細胞中的嘌呤堿基在電化學微檢測系統中具有較好的電化學響應，該電化學法有可能用于細胞內嘌呤的檢測。

參考文獻:

[1]J T Wang, X E Li, J G Liu, et al. Voltammetric behavior of the MCF-7 cell cytoplasm and the effect of taxol on voltammetric response[J]. Anal Biochem, 2009, 394: 229-236

[2]J T Wang, L Y Ge, X Yuan, et al. Detection of the cell viability and proliferation using two-signal electrochemical method[J]. Analyst, 2012, 137:3230-3233

[3]G G Gao, G B Xu, J L Li, et al. Low-level expression of purine bases in BALB/3T3 cells monitored by ultrasensitive graphene-based glass carbon electrode[J].Anal Biochem, 2014, 467:40-46

[4]程冠華，張樹萌，陳年豐，等. MCF-7細胞原位電化學檢測方法研究[J]. 黑龍江醫藥科學,2014，37(1)：91-92

[5]劉慧東，李錦蓮，武冬梅. 裂解溫度對培養板中MCF-7細胞質電化學信號的影響 [J]. 黑龍江醫藥科學，2015，38(2)：10-11

[6]G B Xu, J M Cui, H Liu, et al. Highly selective detection of cellular guanine and xanthine by polyoxometalate modified 3D graphene foam[J]. Electrochim Acta, 2015, 168: 32-40

[7]H W Qin, Q D Gao, H M Niu, et al. An in situ electrochemical detection method of cell viability[J]. Analyst, 2013, 138: 3372-3375

[8]J L Li, R X Lin, Q Wang, et al. Two-signal electrochemical method for evaluation suppression and proliferation of MCF-7 cells based on intracellular purine[J]. Anal Biochem, 2014, 456:1-5

[9]J W Cui, T J Hou, Q Wang, et al. An Enzyme Assisted Electrochemical Detection System of Purine Intracellular Utilizing MWCNTs-IL Modified Glassy Carbon Electrode[J]. Electrochimica Acta, 2015, 180: 360-365

基金項目：①1.國家級大學生創新訓練計劃項目，編號：201310222002；2.佳木斯大學科學技術面上項目，編號：L2014-004；3.佳木斯大學科學技術面上項目，編號：L2012-054。

作者簡介：高寒(1992～)女，山東濟寧人，在校本科學生。 通訊作者：崔繼文(1967～)男，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導師。E-mail：cjwhljjms@163.com。

中圖分類號：R965.2

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)04-0099-02

(收稿日期：2016-04-04)