miRNA-29 調節Wistar大鼠腦缺血再灌注損傷的研究①

李　睿，陳克研，金玉玲

(1.佳木斯大學研究生學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯市腫瘤醫院，黑龍江 佳木斯 154007； 3.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

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miRNA-29 調節Wistar大鼠腦缺血再灌注損傷的研究①

李睿1,2，陳克研3，金玉玲3

(1.佳木斯大學研究生學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯市腫瘤醫院，黑龍江 佳木斯 154007； 3.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：探討微小RNA29(miR-29)在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型中的保護作用及機制。方法：建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，選擇健康成年雄性Wistar大鼠65只，隨機分為假手術對照組和缺血1.5h再灌注2h，3h，6h，12h，1d，2d，3d，7d 組，每組6只，建立線栓法大鼠腦缺血再灌注模型(MACO)，采用定時定量 PCR 法(real time PCR)比較各組病灶組織的 miR-29表達；反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)觀察凋亡相關基因Bcl-2表達的動態變化。結果：MACO組腦缺血病灶組織的miR- 29表達較假手術組降低，而Bcl-2 mRNA表達水平明顯上調(P<0.05)。腦缺血再灌注2h后，大鼠腦缺血周圍區出現凋亡細胞，同時Bcl-2 mRNA 開始表達，隨著缺血再灌注時間的延長呈增高趨勢，1d達高峰，7 d接近假手術組水平。Wistar大鼠腦部MACO后 miR-29 顯著下降，同時Bcl-2的表達上調(P<0.05)，經回歸計算，相關系數R2=-0.9928。結論：miR- 29對Bcl-2負調控可能是抑制腦缺血再灌注損傷的一種機制。

關鍵詞：腦缺血；再灌注；miR-29；Bcl-2；Wistar大鼠

線栓法切斷腦中動脈(middle cerebral artery occlusion，MCAO) 建立局灶性大鼠腦缺血再灌注模型，經長期驗證可以模擬人類腦梗死溶栓及其他血管再通的生理病理過程，是研究腦缺血性再灌注損傷的適用模型[1]。實驗證明，經歷腦缺血再灌注后，神經元死亡包括凋亡和壞死，其中凋亡是主動可逆過程，而能夠調控細胞凋亡的最重要基因之一是Bcl-2[2]，很多學者也通過調節一些重要基因表達，進而減少由腦缺血缺氧引起的細胞凋亡起到保護腦細胞的作用，其中Bcl-2基因調控最為常見[3～5]。此外，微小 RNA 如 miR- 29低表達對心臟缺血再灌注和肝臟缺血再灌注損傷均有保護作用[6]，關于 miR- 29 在腦缺血性再灌注損傷中的作用尚未研究。本實驗重點研究腦缺血再灌注損傷中 miR-29及可能靶基因Bcl-2的表達情況，探討腦缺血性再灌注損傷中，miR-29的可能調控機理。

1實驗材料和動物

1.1實驗動物

240～280g的健康成年雄性Wistar 大鼠65只，由佳木斯大學動物實驗中心提供。

表1　引物序列

1.2實驗材料

RNA 反轉錄試劑盒 PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa，日本)；熒光定量試劑 SYBR Green PCR Mas-terix(Bio-Rad，美國)；組織總RNA 提取試劑 Trizol(Invitrogen，美國)。

2方法和結果

2.1MCAO大鼠模型的制備及分組

Wistar大鼠于環境溫度18～22℃，光暗周期12h飼養。參考Zea-Longa[7]的5分制評分標準對大鼠進行評分并參照評分進行隨機分為9組，假手術組和缺血1.5h再灌注2h，3h，6h，12h，1d，2d，3d，7d 組，去除個別死亡的大鼠、蛛網膜下腔出血者，確保每組6只。應用Zea-Longa 的線栓法阻斷頸外動脈建造腦缺血性再灌注損傷模型。假手術組只需用尼龍線插入10 mm，后手術操作同其他模型組。

2.2實驗動物的取材

依據Collaco-Moraes等[8]的大鼠局灶性腦缺血解剖定位方法，將紋狀體和額葉皮層內側等區域界定為缺血周圍區，紋狀體外側區和將頂葉皮層界定為缺血中心區。取材后，于-80℃冷凍保存，備用。

2.3RT- PCR 法檢測腦組織中 miR- 29 及Bcl-2的表達

參照試劑盒操作說明從上述的冷凍腦組織中提取總RNA， 然后將RNA逆轉錄合成 cDNA第一條鏈。以cDNA 為模板進行PCR反應， 放入定量 PCR 儀按中按照兩步法進行PCR 擴增。條件為94℃2min，94℃20s，50～60℃(依據引物Tm值可變)20s，60℃40s，45cycles。RT-PCR引物序列見表2。

表2　RT-RCR引物序列

2.4體外抑制大鼠腦細胞 miR-29后Bcl-2蛋白表達的檢測

體外培養大鼠腦細胞并匯集，采用轉染試劑將終濃度分別為100、50和0nmol/L miR-29抑制劑，依次瞬時轉染至各組大鼠腦細胞上。經4～6 h更換培養液，于48h收集腦細胞，提取總RNA 及總蛋白，Western blot 檢測蛋白表達情況，RT- PCR 檢測miR-29表達。

2.5統計學方法

3結果

3.1腦缺血再灌注損傷大鼠的腦組織中 miR-29表達

提取各組大鼠腦組織的總RNA，RT- PCR 測miR-29的變化。結果表明，miR-29的表達從再灌注損傷后2h開始下調，12h最低且一直維持至2d，腦組織中的miR-29 表達在缺血再灌注損傷12h時，較比對照組顯著下降，具有統計學意義(P<0. 01)，見圖1。

圖1　腦缺血再灌注損傷大鼠的腦組織中 miR-29表達(**P<0.01)

3.2腦缺血再灌注損傷大鼠的腦組織中Bcl-2 mRNA RT- PCR表達

各缺血再灌注組，缺血周圍區于再灌注后2h后，Bcl-2 mRNA呈弱表達；與再灌注6h時，Bcl-2 mRNA 表達開始增強；在再灌注12h時，Bcl-2 mRNA 表達開始最強，陽性神經細胞數量最多；再灌注2d時，Bcl-2 mRNA表達逐漸減弱；第7天，Bcl-2 mRNA 表達與對照組無顯著性差異。缺血中心區于再灌注2～3h時， Bcl-2 mRNA表達開始減弱，然后迅速提升直至12h可達高峰，隨后開始減弱，在第7天后，Bcl-2 mRNA表達與假手術組無顯著性差異。見表3。

3.3大鼠腦細胞 miR-29經體外抑制 后的 Bcl-2蛋白表達

由實驗結果可知，通過在體外抑制miR-29表達，實驗各組的大鼠腦細胞中Bcl-2蛋白表達隨mmu-miR-29 inhibitor的濃度增加，其表達降低，與對照組比較，當抑制劑濃度為100nmol/L和50nmol/L時具有顯著性差異(P<0. 05)，以抑制劑濃度和miRNA29表達倍數進行回歸計算，所得回歸方程y =-0.0156x+1.84，相關系數R2=-0.9437，由此說明，Bcl-2的蛋白表達與mmu-miR-29抑制劑濃度呈負相關，見圖2。

圖2　體外抑制大鼠腦細胞miR-29后Bcl-2蛋白表達(**P<0.01)

分 組缺血周圍區缺血中心區空白組1.08±0.651.02±0.12缺血再灌注2h26.45±2.11*4.11±0.67**缺血再灌注3h27.22±1.05*4.45±0.89**缺血再灌注6h59.04±2.01**11.72±2.13**缺血再灌注12h113.69±9.24**14.91±10.05*缺血再灌注1d108.21±1.95**13.58±2.10*缺血再灌注2d55.12±1.12*7.09±1.45*缺血再灌注3d21.44±1.21*3.09±1.07缺血再灌注7d1.79±0.251.36±0.72

注：與對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

4討論

缺血再灌注損傷是以腦缺血中心區的神經元壞死為主要特點，驟然缺血便會導致腦能量代謝和供氧，進而部分神經元的部分基因調控未來得及表達便被動死亡。大量凋亡細胞大量出現并有可能凋亡。因此，促進受損神經細胞恢復并抑制細胞死亡，是治療缺血性腦血管損傷疾病的主要途徑之一。桑川等人通過實驗發現Bcl-2蛋白可能是細胞受到嚴重損傷前的基因產物，腦神經細胞在受到輕微損傷時，Bcl-2出現表達，不受刺激不表達或者已經表達的產物失活[9]。本實驗在成功建立大鼠MACO模型后，發現在缺血早期的各不同時間點得Bcl-2的表達變化和細胞凋亡的情況，結果表明缺血周圍區于再灌注后2h后，Bcl-2 mRNA開始表達，再灌注12h時陽表達最強，隨之減少直至再灌注7d與假手術組接近；缺血中心區，再灌注2h Bcl-2 mRNA 弱表達，12h達到高峰，7d后Bcl-2 mRNA 接近假手術組無顯著性差異。

微小RNA 是一類高度保守的非編碼小RNA，對基因表達與調控具有重要作用[10]。本實驗通過對假手術組與模型組的比較分析發現：缺血再灌注損傷模型組的較比假手術組，miR- 29表達明顯降低，而Bcl-2 蛋白表達則明顯上調，以缺血中心區Bcl-2 mRNA和miRNA29表達結果進行回歸計算，所得回歸方程y=-26.377x+32.851，相關系數R2=-0.9928，因此Bcl-2表達與 miR-29表達呈現一定的負相關，結合實驗結果可判斷，在缺血性再灌注損傷的組織中，miR-29通過負調控Bcl-2表達，間接對神經細胞有保護作用。而Bcl-2是否是miR-29的靶基因有待進一步驗證。

參考文獻：

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基金項目：①1.黑龍江省博士后科研基金項目，編號：LBH-Z14204；2.國家博士后科學基金，編號：2015M571454。

作者簡介：李睿(1989～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。 通訊作者：金玉玲(1969～)女，黑龍江密山人， 碩士，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail:jyl2017@sina.com。

中圖分類號：R743

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)03-0005-03

(收稿日期：2016-02-20)

The research on micro RNA29 in regulation of reperfusion for cerebral ischemia injury in Wistar rats

LIRui1,2，CHENKe-yan3,JINYu-ling3

(1. Graduate College of Jiamusi University, Jiamusi 154007, China;2. Jiamusi Tumour Hospital, Jiamusi 154003,China；3. The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China)

Abstract:Objective: To explore the protective mechanism of microRNA29(miR- 29) in regulation of reperfusion for cerebral ischemia injury in Wistar rat. Methods: 65 adult male Wistar rats were randomly divided into sham control group and cerebral ischemia-reperfusion 2h, 3h, 6h, 12h, 1d, 2d, 3d, 7d groups (n=6). Suture method was used to set up the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and reperfusion model. The real time PCR was used to detect the expression of miR-29 and the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was applied to observe the expressions of Bcl-2 in rats brain tissue. Results: The level of Bcl-2 in MACO groups were significantly higher than that in sham control group while the expression of miR-29 in MACO groups were lower(P<0.05). Bcl-2 mRNA positive neurons were observed in the peripheral area in 2 hours after reperfusion. Then the value peaked on in the first day, and decreased to normal level after 7 days. The expression of miR-29 was significantly down- regulated after MCAO in rats(P<0.05),R2=- 0.9928 after regression calculating. The underline protective mechanism is possibly that Bcl-2 is the potential target of miR-29．Conclusion: The negative regulation of miR-29 on Bcl-2 is a mechanism that possibly restrain the brain ischemia-reperfusion.

Key words:cerebral ischemia; reperfusion; miR-29; Bcl-2; Wistar rat