RECK在膽脂瘤型中耳炎中的表達①

于海蓮，周一莎，程秀華，秦迎春

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003;2.雙鴨山市人民醫院耳鼻喉科，黑龍江 雙鴨山 155100)

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RECK在膽脂瘤型中耳炎中的表達①

于海蓮1，周一莎2，程秀華1，秦迎春1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003;2.雙鴨山市人民醫院耳鼻喉科，黑龍江 雙鴨山 155100)

摘要：目的：研究基質金屬蛋白酶抑制劑RECK (reversion-inducing -cysteine- rich protein with Kazal motifs，RECK)在膽脂瘤型中耳炎上皮和正常外耳道上皮中的表達特點及意義，并探討 RECK對膽脂瘤型中耳炎侵襲能力的影響。方法:采用免疫組織化學染色法(SP法)檢測31例膽脂瘤型中耳炎上皮和23例正常外耳道上皮中RECK的表達。結果:31例膽脂瘤上皮組織樣本中，有14例(45.16%)標本檢測到RECK的陽性表達；23例外耳道上皮組織樣本中有21例(91.30%)檢測到RECK的陽性表達，且兩組比較有顯著統計學差異(P<0.01)。結論:RECK在膽脂瘤型中耳炎上皮組織中低表達，在外耳道上皮組織中高表達，預示此因子參與中耳膽脂瘤的發病過程及在病情進展中起到負調節作用。

關鍵詞：膽脂瘤；中耳炎；RECK; 免疫組織化學

膽脂瘤型中耳炎(cholesteatoma of middle ear)是耳鼻咽喉科常見的疾病，是一種位于中耳乳突腔內的囊性結構，而非真性腫瘤，臨床發現，膽脂瘤型中耳炎具有類似于惡性腫瘤的生物學特征，如破壞性、侵襲性、遷移性、異常調控增殖性、復發性等，但本病在病理上屬于良性病變，而非惡性腫瘤[1]。這些特性能使其導致不同程度的骨質破壞，從而引起不同程度的聽力損失，甚至引發前庭功能障礙及面神經麻痹一系列病癥，使患者的生命安全受到嚴重威脅。基質金屬蛋白酶抑制劑 RECK(reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs， RECK)是Takahashi發現的一種新型轉移抑制基因，它的表達與腫瘤的侵潤及轉移、新生血管的形成都有著密切關系。近年來，圍繞RECK與腫瘤侵襲轉移這一主題，先后有肝癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌等相關文獻報道。有文獻報道[2]，RECK的表達量在腫瘤侵襲能力的強弱及患者預后等方面都呈負相關性。RECK對腫瘤生長、侵潤、轉移等過程，可能是通過負性調控MMP-2、9及控制模型基質金屬蛋白酶-1的分泌來完成的。同時其抑制腫瘤血管生成的作用也可抑制腫瘤生長、侵襲和轉移。RECK作為一種基質金屬蛋白酶抑制基因，已被證實能通過下調MMPs的表達及影響腫瘤血管的新生，來抑制多種腫瘤的生物學特性，進而抑制腫瘤的轉移和侵襲[3]。本文采用免疫組織化學方法來檢測RECK在膽脂瘤型中耳炎上皮中的分布及表達水平，根據結果進一步探討在膽脂瘤上皮增殖中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料

①實驗組：31例膽脂瘤型中耳炎上皮組織，標本均來自于佳木斯大學附屬第一醫院耳鼻喉科2013-04～2014-10住院手術的中耳膽脂瘤患者。其中男17例，女14例；年齡25～69歲，平均48.5歲。②對照組：23例正常外耳道上皮組織，標本均來自于佳木斯大學附屬第一醫院耳鼻喉科2013-04～2014-10住院行乳突根治術患者的正常外耳道上皮組織。男12例，女11例；年齡38～80歲，平均55.8歲。

1.2試劑

鼠抗人RECK多克隆抗體,SP試劑盒等均購自上海越研生物科技有限公司。

1.3方法

所有標本均經過甲醛固定，再用酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。經過HE染色并明確病理診斷，切片厚度取4～5μm。RECK應用免疫組化SP法檢測。將石蠟切片、脫蠟、水化，后用3%H2O2室溫孵育10～20min，PBS 沖3min×3；經胰酶消化后37℃孵育箱25min，用PBS沖洗5min×3；再滴入血清室溫孵育5min，用PBS 沖洗；加1抗MMP-14，經4℃過夜，PBS沖洗5min×3;滴入生物素標記的2抗，再經室溫孵育、PBS沖洗；滴加過氧化物親和素酶溶液， 孵育、沖洗；滴加DAB顯色液，鏡下觀測并控制顯色時間；經自來水清洗后用蘇木復染、脫水、透明、封片。用已知陽性對照片作為陽性對照，用PBS 代替1抗作為陰性對照。

2結果判定

所有切片均采用雙盲法進行觀察和計數，避開組織切片的邊緣，選擇顏色明顯強于背景著色處計數。每張病理切片至少在高倍顯微鏡(200×)下觀察10個以上不重復的視野，繼而判斷細胞染色強度和細胞染色百分率為記分方式[4]，得到判斷結果如下：

(1)細胞染色強度(分)：0分：未染色；1分：弱染色；2分：中等強度染色；3分：強度染色。(2)細胞染色百分率(分)：0分 ：0%陽性細胞；1分：≤25%陽性細胞；2分：25%～50%陽性細胞；3分：>50%陽性細胞。兩項計分相加后分成4級，判斷標準為：0分(-)；1～2分(+)；3～4分()；5～6分()。其中"-"示為陰性表達，"+"示為陽性表達。

3統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件包進行處理，陽性率的比較采用χ2檢驗，兩兩比較采用Spearman相關性分析，兩者均以P<0.05作為檢驗標準，差異有統計學意義。

4結果

4.1RECK在正常外耳道上皮組織及膽脂瘤上皮組織中的表達情況，見表1。

4.2RECK在正常組織中有廣泛的表達，陽性信號表達于細胞質內出現淡黃色、黃色、棕黃色顆粒。在中耳膽脂瘤組織中的表達:31例中耳膽脂瘤上皮中陽性表達為14例，陽性表達率為45.16%(14/31),見圖1；在外耳道上皮組織中表達較高，多位于細胞漿，呈棕黃色或棕褐色顆粒，23例中陽性表達為21例，陽性表達率為91.30%(21/23),見圖2。RECK在膽脂瘤中的表達明顯低于正常外耳道上皮中，差異有統計學意義(χ2=6.973，P<0.05)。

圖1　RECK在膽脂瘤組織中陰性表達(SP×200)

圖2　RECKA在外耳道上皮中陽性表達(SP×200)

RECK-+總例數陽性率(%)中耳膽脂瘤組1795031(14)45.16外耳道上皮組2251423(21)91.3

注：χ2=6.973 ，P<0.05。

5討論

RECK基因是長約87kb，定位在染色體9p13-p12上的一種抑癌基因，它具有獨特的抑制MMPs活性與表達的功能。由日本學者 Takahashi等在1998年的v-Ki-ras轉染小鼠纖維原細胞株NIH3T3中發現的[5]。許多研究證實，RECK基因起著負向調控許多癌基因的作用。研究表明[6]，許多腫瘤的發生、發展與RECK基因定位的區域密切相關。新生血管給腫瘤的持續增長提供了氧分和能量，MMPs的高度表達能夠促進血管形成，它是通過過度降解ECM來實現的。RECK高表達時，能夠抑制MMPs的表達，進而抑制血管的形成，RECK對于MMPs的這種調節關系，在腫瘤血管形成中十分重要。許多研究已經證實[7]RECK在腫瘤中的表達強度與其內部血管的多少呈現負相關性，RECK作為一種基質金屬蛋白酶抑制基因，已被證實能通過下調MMPs的表達及影響腫瘤血管的新生，來抑制多種腫瘤的生物學特性，進而抑制腫瘤的轉移和侵襲。目前的研究己經回答了許多問題，但是有很多的問題還有待解決。本實驗采用免疫組化 SP法，檢測 RECK在膽脂瘤型中耳炎上皮組織中及正常外耳道上皮組織中的表達，結果發現，RECK在正常組織中有廣泛的表達，陽性信號表達于細胞質內出現淡黃色、黃色、 棕黃色顆粒狀。在膽脂瘤型中耳炎上皮組織中的表達，31例膽脂瘤上皮組織中陽性表達為14例，陽性表達率為45.16%；在外耳道上皮組織中表達較高，多位于細胞漿，呈棕黃色或棕褐色顆粒，23例中陽性表達為21例，陽性表達率為91.30%；RECK在膽脂瘤中的表達明顯低于正常外耳道上皮中，差異有統計學意義(χ2=6.973，P<0.05)。以上結果可能預示了RECK的表達缺失或降低在膽脂瘤型中耳炎的生成與發展的過程中起著重要作用。可能對膽脂瘤型中耳炎的生成與發展有著抑制的作用，其低表達可能引起膽脂瘤發病幾率增高。

RECK在膽脂瘤型中耳炎上皮組織中低表達，在外耳道上皮組織中高表達，可能說明此因子參與膽脂瘤型中耳炎的發病過程及在病情進展中起到負調節作用。

參考文獻:

[1]Arroyo A G,Genis L,Gonzalo P,et al.Matrix metallo proteinases:new routes to the use of MTI-MMP as a therapeutic target in angiogenesis-relateddisease[J].Curr-Pharm Des,2007,13(17):1787-1802

[2]張愛華，周一莎.基質金屬蛋白酶-14在膽脂瘤型中耳炎中的表達及意義[J].黑龍江醫藥科學, 2015，38(3):35-36

[3]閻紅娥,梁姍姍,鮑文華，等.RECK及MMP-9在非小細胞肺癌中的表達及意義[J]. 黑龍江醫藥科學, 2013，36(2)：11-13

[4]Tsunezuka Y,Kinoh H,Takino T,et a1.Expression of membrahe-type matrix Metalopmteinase1 (MT1-MMP) in tumor cells enhances pulmonary metastasis in an experimental metastasis assay[J].Cancer Res,1996,56(24)：5678-5683

[5]周旭峰，姚雅芬． MMP-2和CD147在中耳膽脂瘤中的表達[J]．黑龍江醫藥科學，2008，31(3):27-28

[6]李江華，張愛華，周旭峰． 中耳膽脂瘤上皮組織中 OPN 和 MMP9的表達及相關性研究[J]． 黑龍江醫藥科學，2013，36( 2):78-79

[7]周旭峰,張愛華,范宗憲，等.XIAP和XAF1在中耳膽脂瘤中的表達及其與細胞凋亡的關系[J]． 黑龍江醫藥科學，2013，36(2):65-66

基金項目:黑龍江省自然科學基金，編號:QC2010076。

作者簡介：于海蓮(1966～)女，黑龍江佳木斯人，本科，副主任護師。 通訊作者:秦迎春 (1968～) 女，黑龍江佳木斯人，本科，副主任護師。E-mail:milk821053941@163.com。

中圖分類號：R764.21

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)03-0013-02

(收稿日期：2015-12-02)