結直腸癌對腸壁神經系統形態學的影響①

王雪成,葛　欣,劉振平

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003;2.黑龍江省醫院，黑龍江 哈爾濱 150086)

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結直腸癌對腸壁神經系統形態學的影響①

王雪成1,葛欣2,劉振平1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003;2.黑龍江省醫院，黑龍江 哈爾濱 150086)

摘要：目的:觀察結直腸癌對腸壁神經系統形態學的影響。方法：收集2014～2015年的T3～T4期結直腸癌組織40例，正常組織10例。應用免疫組織化學法與病理顯微鏡圖像分析軟件，檢測結直腸癌組中黏膜下神經淺叢、深叢及肌間神經叢的陽性染色區域的平均吸光度并與正常組進行對比。結果：結直腸癌組中神經排列紊亂、直徑變細，甚至神經元及神經纖維的消失，而正常組中神經形態規則，排列整齊，分布均勻。正常組中黏膜下神經淺叢的平均吸光度(0.20±0.07)、深叢的平均吸光度(0.16±0.08)及肌間神經叢的平均吸光度(0.21±0.06)，明顯高于結直腸癌組中黏膜下神經淺叢的平均吸光度(0.12±0.03)、深叢的平均吸光度(0.11±0.04)及肌間神經叢的平均吸光度(0.16±0.05)，且差異均有統計學意義(P<0.05)。結論：結直腸癌對腸壁神經系統的破壞，可能是引起患者臨床癥狀的一個原因。

關鍵詞：結直腸癌；腸神經系統；免疫組織化學

結直腸癌的發病率占我國惡性腫瘤的第4位[1]。大部分的結直腸癌起源于腺瘤，腺瘤惡變后依次侵犯黏膜下層、肌層直至漿膜層。在結直腸癌發生、發展的過程中會逐漸破壞腸道的腸壁神經系統。有學者提出[2]，結直腸癌患者排便習慣和規律的變化,可能與癌細胞對腸壁神經系統的破壞相關。然而，關于結直腸癌患者腸壁神經系統形態學改變的相關研究還比較缺乏，為此，我們應用蛋白基因產物9.5(Protein Gene Product 9.5，PGP9.5)作為神經的標記物，分別檢測正常組與結直腸癌組中黏膜下神經淺叢、深叢及肌間神經叢的陽性染色區域的平均吸光度，探討結直腸癌對腸壁神經系統的影響。

1資料和方法

1.1一般資料

收集黑龍江省醫院2014-01～2015-06，手術切除的T3～T4期結直腸癌組織40例為結直腸癌組(左半結腸癌13例，橫結腸癌6例，右半結腸癌4例，乙狀結腸癌13例，直腸癌4例)，其中男25例，女15例，年齡37～83歲，切除標本經病理檢查，證實為T3～T4期結直腸癌。取距離手術切緣5cm以上的正常結直腸組織10例為正常組(左半結腸癌2例，橫結腸癌1例，右半結腸癌4例，乙狀結腸癌1例，直腸癌2例)，其中男6例、女4例，年齡39～50歲，術后病理證實為正常組織。所有標本均應包括腸道全層，病人術前均未接受過放化療，也無其它嚴重性疾病。

1.2方法

所有標本經中性福爾馬林固定，常規脫水、包埋、切片10微米、切片常規脫蠟，抗原熱修復，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS緩沖液沖洗封閉，加一抗PGP9.5(購自北京中杉金橋，ZA-0263)，PBS緩沖液沖洗，滴加二抗及辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。

1.3免疫組化染色判讀

用德國萊卡公司生產的顯微鏡觀察切片，在低倍鏡(×100)下分別觀察，黏膜下神經淺叢、深叢及肌間神經的陽性表達情況，再轉換成高倍鏡(×400)，每個神經叢區域隨機選取5個不重疊高倍視野，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量積分吸光度和陽性染色區域的面積，計算單位面積染色區域平均吸光度。

1.4統計學方法

2結果

2.1結直腸癌組與正常組中腸壁神經系統的形態

PGP 9.5廣泛分布于腸壁神經系統中的神經元及神經纖維。在正常組中可以觀察到PGP 9.5陽性表達的三條神經叢，分別為走行于黏膜固有層的黏膜下神經淺叢，走行于黏膜肌層的黏膜下神經深叢和走行于環形與縱行肌之間的肌間神經叢。在正常組中，PGP 9.5陽性表達的黏膜下神經淺叢、深叢及肌間神經叢的形態規則，排列整齊，分布均勻，見圖1。在結直腸癌組中，可以看到癌細胞改變了正常神經叢的走向，使神經叢排列更加紊亂、進一步扭曲，直徑變得更細，甚至神經元及神經纖維的消失，見圖2。

圖1PGP 9.5免疫反應陽性神經叢(×100)圖1A:正常組；1B:結直腸癌組；圖中a:黏膜下神經淺叢；b：黏膜下神經深叢；c：肌間神經叢

2.2結直腸癌組與正常組中各神經叢平均吸光度的比較

正常組中黏膜下神經淺叢的平均吸光度(0.20

±0.07)、深叢(0.16±0.08)及肌間神經叢的平均吸光度(0.21±0.06)，明顯高于結直腸癌組中的黏膜下神經淺叢的平均吸光度(0.12±0.03)、深叢(0.11±0.04)及肌間神經叢的平均吸光度(0.16±0.05)，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　結直腸癌組和正常組中黏膜下神經淺叢、深叢、肌間神經叢的平均吸光度表達±s)

圖2　正常組PGP 9.5免疫反應陽性神經叢(×200)　2A：黏膜下神經淺叢；2B：黏膜下神經深叢；2C：肌間神經叢

圖3　結直腸癌組PGP 9.5免疫反應陽性神經叢(×200)　3A：黏膜下神經淺叢；3B：黏膜下神經深叢；3C：肌間神經叢

3討論

結直腸癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一[3]。目前的研究絕大部分關注于腫瘤患者的預防和治療上，而關于其腸道功能的研究鮮有報道。腸壁神經系統是腸道特有的外周神經系統，其神經元和神經纖維組成完整的神經反射弧，可以不依賴中樞神經系統自主的發揮各種功能。在結直腸癌患者中，癌細胞無疑會破壞腸壁神經系統，引起腸壁神經系統形態和功能的變化。我們的研究顯示，癌細胞侵犯的腸壁，會出現神經叢排列紊亂和扭曲，直徑變細，甚至神經元及神經纖維的消失的現象。以及局部區域神經纖維的吸光度在癌組織中明顯較正常組織減低。

PGP9.5廣泛分布于中樞與外周神經系統的神經元、神經纖維以及各種神經內分泌細胞中，與傳統神經染色相比，PGP9.5具有操作簡單，價格低廉，清晰等優勢。在國外PGP9.5已經被廣泛應用于癌組織中神經的標記，如前列腺癌[4,5]、結直腸癌[6]、鱗癌[7]及外周神經腫瘤[8]，而國內僅有PGP9.5用于乳腺癌中[9]神經標記的報導。因此，我們選用PGP9.5標記結直腸癌組和正常組中的腸壁神經系統。我們的結果表明PGP9.5能良好的顯示神經叢的形態，是觀測腸壁神經系統良好的指標。已經有研究證實平均吸光度是能夠準確反映物質含量的指標，因此我們選用這個指標來證實結直腸癌對腸壁神經系統的破壞。由于腸壁神經系統中各神經叢對腸道的作用不同，所以我們分別對比正常組與癌組中，黏膜下神經淺叢、深叢及肌間神經叢的平均吸光度的變化，來推測不同神經叢的破壞所導致患者出現的癥狀。

我們的研究顯示，結直腸癌引起黏膜下及肌間神經叢的平均吸光度均明顯減低(P<0.05)。分析原因可能是由于，結直腸癌在發展的過程中會逐漸破壞腸道的粘膜下及肌間神經叢，使各神經叢發生斷裂，直徑變細，甚至神經元及神經纖維的消失。Godlewski[2]的研究成果似乎也可以證明這個原因，結直腸癌組織侵犯到黏膜下層時，引起黏膜下神經叢位置發生改變，甚至神經元及神經纖維的消失。當癌組織侵犯到肌層時，就會破壞肌間神經叢的正常形態，使肌間神經叢變形、結構破壞甚至消失。我們的實驗僅用了PGP9.5對腸壁神經系統進行標記，還有關于PGP9.5和神經遞質抗體雙標記的報導[10,11]，研究顯示結直腸癌侵犯黏膜下及肌間神經叢時，分泌降鈣素基因相關肽與神經肽Y的神經元數目及神經纖維密度均明顯減低，而分泌P物質與垂體腺苷酸環化酶激活肽的神經纖維密度明顯減低。降鈣素基因肽、神經肽Y、垂體腺苷酸環化酶均為抑制性神經遞質，這些神經遞質的減少可能引起結直腸癌患者腹瀉的癥狀。P物質為興奮性神經遞質的代表，它的減低可能引起結直腸癌患者便秘的癥狀。

然而，也有不同的報道，Sitohy[12]等人的研究顯示，結腸癌大鼠的黏膜下及肌間神經叢的相對密度明顯比正常組增高(P<0.05)。Liebl等人[13]檢測神經軸突的密度，發現直腸癌細胞能刺激神經的再生，結腸癌細胞中缺少神經生長因子、生長相關蛋白-43及神經營養因子抗體,而沒有發現神經再生現象。Albo[14]等人，將游離的背根神經和結腸癌細胞(KM12)共同培養，結果發現這種背根神經神經比不加入結腸癌細胞的背根神經出現明顯的神經再生。這些結論與我們研究成果可能是矛盾的，一方面可能是由于Basel選擇的標本與我們標本的種屬差異。另一方面Liebl與Albo等人均是選擇離體培養癌細胞，與我們選擇的標本不同。Albo[14]等人還檢測了236例結直腸癌病人標本，其中在63%的標本中發現有不同程度的神經再生。雖然Albo也選用了結直腸癌病人的標本，但缺少標本分期的具體信息。而我們實驗選擇的標本均為T3～T4期結直腸癌標本，這些癌細胞破壞能力更強，可能將新生的神經也都破壞掉了。新的研究發現惡性腫瘤中有神經再生的現象，通過前面文章的報導也可以證明了這一觀點。我們在閱片時也曾發現1例，直腸癌組織的肌間神經叢直徑比正常組明顯增粗。所以我們分析，可能使當結直腸癌侵犯到黏膜下或黏膜肌層時破壞了黏膜下神經叢，機體應激性產生一些神經生長因子，刺激與黏膜下神經叢相互聯絡的肌間神經叢出現再生的現象。所以我們下一步準備選取T1～T2期的結直腸癌標本，觀察結直腸癌組中肌間神經叢的變化情況。

腸壁神經系統是腸道特有的外周神經系統，其興奮性和抑制性神經元存在精細而又復雜的平衡關系。結直腸癌在發生、發展的過程中，會逐漸破壞腸壁神經系統中的興奮性與制性神經元。當興奮性神經元占優勢時，患者可能出現腹瀉的癥狀。相反，抑制性神經元占優勢時，患者可能出現便秘的癥狀。因此，我們可以推斷結直腸癌對腸壁神經系統的破壞，可以解釋患者出現的臨床癥狀，但這只是其中的一個原因。

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基金項目：①佳木斯大學研究生科技創新課題，編號：LM2015_027。

作者簡介：王雪成(1989～)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。 通訊作者：葛欣(1970～)男，黑龍江哈爾濱人，博士，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail：gexincom@163.com。

中圖分類號：R735.3+7

文獻標識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)03-0037-03

(收稿日期：2016-02-18)