小鼠胚胎胸腺移植方法和實驗研究①

徐太哲，李　麗，王長山

(1.佳木斯市紅十字醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003 ；2.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

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小鼠胚胎胸腺移植方法和實驗研究①

徐太哲1，李麗2，王長山2

(1.佳木斯市紅十字醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003 ；2.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的：探討T細胞剔除的同種胎胸腺在老齡小鼠腎被膜下血運重建、免疫功能和外周血T細胞池重建恢復。方法:對10只胸腺老化萎縮的BALB/c老齡(16月齡)小鼠施行胚胎胸腺移植,供體為BALB/c小鼠妊娠14d(E14d)的胎鼠,將胎鼠胸腺小葉移植于受體BALB/c老齡(16月齡)小鼠腎被膜下,無菌縫合結扎逐層結扎封閉腹腔。術后連續(xù)5d給予環(huán)孢素A 10mg/kg 體重靜脈注射。結果:受體BALB/c老齡(16月齡)小鼠10只全部存活,無排斥反應,移植后移植胸腺恢復血運，重建免疫、恢復免疫功能。結論:老齡小鼠胸腺組織在腎被膜下移植3周后血運重建良好，術后6周恢復發(fā)揮對新生T淋巴細胞選擇發(fā)育功能。

關鍵詞：胚胎胸腺;胸腺移植;胸腺萎縮

胸腺移植不僅能誘導移植免疫耐受,還可以使動物機體獲得免疫重建。胸腺移植已越來越多的國內外學者用于治療多種疾病。本研究旨在建立一種小鼠胚胎胸腺移植動物模型,觀測胚胎胸腺移植的受體小鼠外周血T細胞池獲得重建和恢復情況，更好為開展基礎實驗研究和臨床胸腺移植奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

實驗動物組：供體BALB/c妊娠14d(E14d)小鼠10只,不限雄雌，單次鈷(60Co )全身均勻5Gy強度輻射(劑量率為:0.8Gy/min)，去除供體胸腺內T淋巴細胞。受體BALB/c老齡(16月齡)小鼠10只，體重24～27g。對照動物組：BALB/c老齡(16月齡)小鼠10只，體重24～27g。

1.2方法

①麻醉方法:1%戊巴比妥鈉60mg/kg體重腹腔內注射。②建立胸腺移植模型：供體BALB/c手術:將供體BALB/c妊娠14d(E14d)小鼠胎盤分離出，無菌取胎鼠，斷頭，體視鏡下摘取胎鼠胸腺小葉于培養(yǎng)液中，待用。③受體BALB/c手術：BALB/c老齡(16月齡)小鼠無菌麻醉、消毒后，取腰背左側中縱行切口，顯露左側腎臟，腎被膜處制孔，在體視鏡下將胸腺小葉植入16月老齡小鼠腎被膜下。無菌縫合結扎逐層結扎封閉腹腔。術后連續(xù)5d給予環(huán)孢素A 10mg/kg 體重靜脈注射，安置在SPF級飼養(yǎng)室內，分籠單獨飼養(yǎng)4～6周后取移植胸腺標本,在光鏡下觀察胸腺組織結構變化。

1.3統(tǒng)計學方法

2結果

受體BALB/c老齡(16月齡)小鼠10只全部存活,供體胎鼠胎胸腺移植于左側腎臟腎被膜下，術后4周，打開腹腔，光鏡下觀察移植胸腺無明顯縮小，胸腺組織結構基本正常,未見明顯排斥現象。術后5周，觀察移植胸腺組織在腎臟被膜下繼續(xù)發(fā)育，呈半球形，顏色瓷白，表面可見數條細小的血管。

圖1　左圖為供體BALB/c小鼠妊娠14d的胎鼠，右圖為妊娠14d胎鼠的胸腺。

圖2移植5周后胎鼠胸腺組織的在腎臟被膜下生長情況。綠色箭頭所指為生長狀態(tài)下移植的胸腺組織，圖左側是未移植胸腺的腎臟，圖右側是移植胸腺5周后的腎臟。

移植的老齡小鼠T淋巴細胞的恢復效果，流式細胞分析老齡移植小鼠相比同齡對照，CD4+細胞百分含量分別為：14.07±4.13，10.95±6.63，差異不顯著；CD8+細胞百分含量分別為：25.12±13.53，12.96±11.64，差異顯著；CD4+/ CD8+比值分別為：0.59±0.56，0.82±0.27，差異不顯著。

表1　老齡移植小鼠與對照的脾臟CD4+細胞、CD8+細胞的百分含量和CD4+/CD8+

注：*表示差異顯著(P<0.05)。

3討論

胸腺移植的方法有很多，胸腺細胞及胸腺移植被國內外許多學者建模和應用治療多種疾病：Hong[1]和Dupuy[2]等人通過移植胸腺細胞，恢復淋巴細胞功能，治療免疫缺陷病；通過移植胸腺上皮細胞，改善免疫功能低下的人體。Danner[3]等人通過胸腺組織塊移植治療愛滋病患者，Ortak[4]等人通過將帶血管的胸腺移植來重建移植胸腺的血液供應，目前國內已建立相應的動物模型，Lambrigts[5]等人的胸腺與其他臟器聯(lián)合移植。在國內，徐春岳等[6]將大鼠胚胎胸腺與后腎原基聯(lián)合移植至無胸腺裸小鼠,探討了聯(lián)合移植能否重建受體細胞免疫功能。付繼成等[7，8]將正常胚胎小鼠胸腺移植于2月齡的雄性 BXSB小鼠體內治療紅斑狼瘡和改善BXSB雄性小鼠腎功能。徐高四等[9]也探討了胚胎胸腺組織移植對系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)模型鼠的治療效果。胡正等[10]將凍融處理或新鮮的人胚胎胸腺移植入小鼠腎被膜下1～3mm處，良好地支持人胸腺發(fā)育。在國外，Zhu X等[11]利用胚胎胸腺移植，恢復血運，免疫重建、恢復功能。

目前國內尚未見小鼠胚胎胸腺移植動物模型建立的報道。與國外動物模型相比,我們采用的移植物為胎胸腺小葉,可充分發(fā)揮胎胸腺功能、利于最大限度地發(fā)揮移植胎胸腺的功能。我們胸腺移植受體部位是腎被膜下，該部位局部血液供給較豐富，手術簡單，便于手術觀察移植物的變化等優(yōu)點，朱世濱等[12]也觀察了腎包膜下胰島移植對移植物存活情況。我們在進行手術時，采用妊娠14d(E14d)胎鼠胸腺，胚胎胸腺組織對于受體而言，抗原性低，而適合用來移植，移植后容易形成免疫耐受，有利于在同種異體或異種受者中存活，楊崇賢等[13]曾用胚胸腺組織漿液注射治療慢性病毒性肝炎。胎鼠胸腺內T淋巴細胞鈷剔除技術,張濤等[14]曾探討過(60)Co照射小鼠免疫功能的影響，這樣大大縮短了移植胸腺恢復血運時間,對老齡小鼠恢復免疫起重要作用,建立了較為成功的胎胸腺移植動物模型。

參考文獻：

[1]Hong R， Santosham M， Schulte-Wissermann H，et al.Reconstitution of B and T lymphocyte function in severe combined immunodeficiency disease after transplantation with thymic epithelium[J].Lancet，1976，2(7998):1270-1272

[2]Dupuy JM1， Gilmore N， Goldman H， et al. Thymic epithelial cell transplantation in patients with acquired immunodeficiency syndrome. Evidence for infection by HIV-I of newly differentiated T cells at the site of transplantation[J]. Thymus，1991，17(4):205-218

[3]Danner SA， Schuurman HJ， Lange JM， et al. Implantation of cultured thymic fragments in patients with acquired immunodeficiency syndrome[J]. Arch Intern Med，1986，146(6):1133-1136

[4]Ortak T， Oke R， Unsal M， et al. A model of vascular thymus transplantation in athymic rats[J]. Transplant Proc，2001，33(1-2):372-374

[5]Lambrigts D， Menard MT， Alexandre GP， et al. Creation of the “thymoheart” allograft: implantation of autologous thymus into the heart prior to procurement[J]. Transplantation，1998，66(6):810-814

[6]徐春岳, 徐劍, 姚水洪. 大鼠胚胎胸腺和后腎原基聯(lián)合異種移植與誘導免疫耐受的初步研究[J]. 中華微生物學和免疫學雜志, 2012, 32(3):87

[7]付繼成, 徐世正, 周心房,等. 胚胎胸腺移植治療BXSB小鼠自發(fā)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究[J]. 中華皮膚科雜志, 2003, 36(1):28-30

[8]付繼成, 方春紅, 周心房,等. 胚胎胸腺移植對BXSB小鼠干擾素γ和白介素4的影響[J]. 中華皮膚科雜志, 2003, 36(10):603-603

[9]徐高四, 劉巧云, 曹會生,等. 異基因小鼠胚胎胸腺移植治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型鼠的實驗觀察[J]. 中國皮膚性病學雜志, 2005, 19(6):336-337

[10]胡正, 夏金星, 楊永廣. 人胸腺前體細胞長期生存并支持胸腺發(fā)育[C]// 第九屆全國免疫學學術大會論文集，2014

[11]Zhu X， Gui J， Dohkan J， et al. Lymphohematopoietic progenitors do not have a synchronized defect with age-related thymic involution[J]. Aging Cell，2007，6(5):663-672

[12]朱世濱, 李翔. 大鼠胸腺內豬胰島異種移植的實驗研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學, 2006, 29(3):18-19

[13]楊崇賢, 邱守義, 張菊影,等. 人胚胸腺組織漿液注射治療慢性病毒性肝炎的療效觀察[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學, 1979，12(1):22

[14]張濤, 柳朝陽, 王建杰,等. 十全大補湯對(60)Co照射小鼠免疫功能的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學, 2003，36(5):60

基金項目：①1.黑龍江省普通高等學校青年學術骨干支持計劃，編號：NO.1253G057;2.佳木斯大學自然科學基礎研究類重點項目，編號：Sjz2012-11。

作者簡介：徐太哲(1967～)男，吉林吉林人，本科，主治醫(yī)師。 通訊作者：王長山(1977～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副教授，主要從事胸腺微環(huán)境。E-mail：wcs0451@163.com。

中圖分類號：R655.7

文獻標識碼：B

文章編號：1008-0104(2016)03-0110-02

(收稿日期：2016-02-29)