Apelin-13對腦缺血再灌注損傷作用的初步研究*

蒯錦霞包海軍李周儒董國凱殷文江孫曉明李姍姍蔡紅星

Apelin-13對腦缺血再灌注損傷作用的初步研究*

蒯錦霞①包海軍①李周儒①董國凱①殷文江①孫曉明①李姍姍①蔡紅星①

【摘要】目的：研究Apelin-13對缺血/再灌注小鼠腦損傷的作用，并初步探討其對自噬性細胞死亡的影響。方法：取健康雄性CD-1小鼠，隨機分為假手術（sham）組、生理鹽水（Saline）組、Apelin組；Apelin組和Saline組首先建立腦缺血再灌注（MCAO/R）模型，再灌注即刻給予同側側腦室注射Apelin-13或等量生理鹽水，然后在再灌注48 h后，進行神經功能方面檢測，同時利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色評估腦梗死體積；缺血再灌注24 h和48 h后，采用West-blot法檢測各組自噬相關蛋白LC3的表達情況。結果：Apelin-13可顯著降低小鼠腦缺血再灌注后神經功能缺損癥狀，減少腦梗死體積，減低自噬相關蛋白LC3的表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值。結論：Apelin-13對小鼠腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用，抑制神經細胞的自噬性死亡可能是其作用機制之一。

【關鍵詞】Apelin-13； 腦缺血再灌注模型（MCAO/R）； 自噬； LC3

First-author’s address：Xuzhou Medical University，Xuzhou 221002，China

腦缺血缺氧可引起的神經細胞結構破壞和腦功能的缺損，腦缺血再灌注損傷是腦缺血缺氧后恢復缺血區血供的又一次損傷，也是一種繼發性神經元損傷，與神經細胞的繼發性神經元死亡密切相關［1］。近年來有研究表明自噬與腦缺血損傷的發生、發展有著密切的關系［2-3］。研究發現脂肪因子Apelin-13能夠對神經細胞的損傷發揮保護作用，但其具體作用機制還不甚明了［4-6］。本實驗擬通過觀察Aplin-13在腦缺血再灌注損傷中是否起到了保護性作用，并通過檢測自噬相關蛋白LC3的表達，研究其對神經細胞自噬的影響，探討其在缺血再灌注腦損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 共48只健康雄性CD-1小鼠，體重30～35 g（由徐州醫學院動物實驗中心提供），隨機分為如下各組，實驗1：sham組6只、Saline組6只、Apelin-13組6只，共18只用于行為學檢測和TTC實驗；實驗2組：sham組、再灌注24 h Saline組、再灌注48 h Saline組、再灌注24 h Apelin-13組、再灌注48 h Apelin-13組，每組6只，共30只用于Western-Blot測定。

1.2 小鼠MCAO/R模型的制備 參照甄毅嵐等［6］的線栓法制作左側大腦中動脈閉塞（MCAO）模型。小鼠用7%的水合氯醛（0.05/10 g）腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術臺上，酒精擦拭頸部消毒，行頸部正中切口、鈍性分離左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈。結扎頸外動脈近端，在頸總動脈近心端結扎，遠心端掛線備用。微動脈夾夾住頸內動脈，在頸總動脈上于分叉處約3 mm處剪一小口，插入專用線栓，將預制的活結稍打緊（防止線栓脫出）。打開夾住頸內動脈的動脈夾，將線栓緩慢插入頸內動脈，大約9 mm時感到有一定阻力停止推進，且向外拔1mm用絲線固定，阻斷大腦中動脈起始部血流且不刺破血管。傷口以碘伏消毒，縫合頸部皮膚，保留線栓3～4 mm，術后動物側臥置于單獨的籠內。缺血后60 min，緩慢向外拉線10 mm，使其頭端回撤至頸總動脈內，計時實施再灌注。Saline組、Apelin-13組采用線栓法建立小鼠MCAO/R模型；sham組僅給予分離血管，不予結扎及栓塞血管。Apelin組于再灌注即刻給予同側側腦室注Apelin-13 （0.33μg/g；注射定位：前囟左側1 mm，后1 mm，深度2.5 mm），Saline組給予同側側腦室等量的生理鹽水注射。

1.3 神經功能評分及大腦梗死體積檢測 MCAO/R 48 h后，采用改良Bederson評分法進行神經功能缺損評分［7］。評分標準：0分，無明顯神經病學癥狀；1分，不能完全伸展右側前爪（左側手術）；2分，向右側旋轉；3分，行走時向右側傾倒；4分，不能自行行走。0分及昏迷不醒者剔除。神經功能評分后，對腦組織進行TTC染色，正常組織呈鮮紅色，梗死組織呈白色。SD小鼠在水合氯醛麻醉下心內灌注處死，冰板上快速斷頭取腦。把腦放入-20 ℃冰箱中冷凍，20 min后取出，切成2 mm的冠狀切片，泡入1%TTC溶液中，37 ℃水浴箱中30 min，甲醛固定，圖象分析儀測梗死體積。每只小鼠腦總梗死體積MV=Σ（A1+A2）t/2，其中t為切片厚度，A1和A2分別表示切塊嘴、尾側梗死面積。同樣方法計算同側大腦半球體積，計算出梗死灶體積占缺血側大腦半球體積的百分比。

1.4 Western-Blot的檢測 Saline組和Apelin-13組按時間點開顱取出小鼠傷側的海馬組織，sham組取同側海馬組織，提取蛋白質，采用12%的SDSPAGE膠進行蛋白質分離，等量（10 μL）蛋白樣品上樣。恒壓電泳，全濕式電轉法將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，麗春紅染NC膜可見清晰的紅色條帶，表明蛋白質轉膜成功。NC膜用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉NC膜4 h。分別加入一抗（抗GAPDH抗體，1∶1000；抗LC3抗體，1∶5000），4 ℃孵育過夜；二抗（生物素標記羊抗兔IgG，1∶1000稀釋），4 ℃孵育1 h；用辣根酶標記親和素（1∶1000稀釋）與二抗結合，4 ℃孵育1 h，以上操作均在搖床上進行，且各步驟間均用TBST洗膜5 min×5次（操作分別按相關試劑盒說明書進行）。膜上加ECL超敏發光液，保鮮膜包好后，暗室內曝光30 s，X線片在顯影液中顯影2 min，定影液中定影5 min。最后利用Quantity One（Bio-Rid）軟件分析蛋白光密度值。

1.5 統計學處理 應用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗和方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能評分 按照改良Bederson評分法，統計結果顯示：MCAO/R 48 h后， Saline組Bederson評分（3.13±0.23）分與sham組（0.63±0.18）分相比顯著升高（P＜0.05），提示腦缺血再灌注后造成明顯的神經功能缺損。術后48 h，Apelin-13組Bederson評分（2.38±0.18）分與Saline組相比有所降低（P＜0.01），提示Apelin-13能夠顯著改善腦缺血再灌注后神經功能的缺失。見圖1。

2.2 腦梗死體積檢測 腦梗死范圍測定是評價腦缺血損傷的金指標，缺血再灌注48 h后，TTC染色，sham組小鼠腦組織表現為均勻一致的鮮紅色，無明顯梗死灶形成；Saline組和Apelin-13組腦組織出現范圍不等的白色梗死區域。Saline組梗死區域體積比例（22.35±1.50）明顯高于sham組（0.52±0.20）（P＜0.01），提示腦缺血再灌注后造成明顯的大腦梗死。術后48 h， Apelin-13組腦梗死體積比例（10.55±1.01）與Saline組相比明顯降低（P＜0.01），提示Apelin-13能夠顯著降低缺血再灌注小鼠的梗死體積。見圖2。

圖1 缺血再灌注48 h后神經功能評分檢測結果

圖2 缺血再灌注48 h后大腦梗死體積比的統計結果

2.3 Western-Blot的檢測結果 通過對MCAO/R后受損海馬區神經細胞的LC3的表達分析發現，再灌注后24、48 h，Saline組海馬區的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（0.366±0.319）、（0.408±0.035）與sham組（0.193±0.034）相比均增加，且在48 h達高峰，Apelin-13組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比 值（0.243±0.031）、（0.291±0.027）與Saline組相比從24 h開始顯著降低，并且持續到了48 h，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

Apelin為孤兒G蛋白耦聯受體APJ的天然配體，Apelin及其受體APJ廣泛分布在中樞神經系統及外周［8-9］，在中樞神經系統 中，Apelin參與應激以及痛覺的調制等生理作用；在心血管系統中，Apelin可調節心肌收縮力和降低動脈血壓［10-11］。近年來有研究發現Apelin有顯著抑制細胞凋亡的作用［12-13］，而自噬與凋亡有著共同的調節因子，及復雜的相互調節關系。自噬作為一種早期的自我適應性機制，能清除受損的細胞器和蛋白，為組織穩態的恢復提供營養物質和能量［14］。因此通過調控細胞自噬的發生，可成為治療缺血再灌注腦損傷的一種新的嘗試手段。

圖3 Western-Blot的檢測結果

本實驗通過對腦室注射Apelin-13觀測其對腦神經的保護作用，結果顯示，與Saline組相比，Apelin-13組小鼠神經功能缺失顯著降低，表明Apelin-13可明顯改善腦缺血再灌注損傷后小鼠的神經功能缺損，發揮保護神經的作用。同時，本實驗還采用了TTC染色法觀察梗死體積，與Saline組相比，Apelin-13組腦缺血再灌注損傷的腦梗死體積明顯減少，進一步表明Apelin-13對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

通過Western-Blot的檢測結果，筆者發現Apelin-13能顯著的降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值。LC3蛋白是哺乳動物細胞中酵母ATG8基因的同源物，靶向定位于自噬體膜，參與自噬體的形成，被認為是觀察自 噬是否存在的標記性分子［15-19］，有Ⅰ型和Ⅱ型之分。哺乳動物細胞發生自噬時，細胞內LC3的含量及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化均明顯增加，LC3-Ⅱ含量的多少與自噬泡數量的多少成正比［20-24］。因此，通過檢測細胞內LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的變化，可以明確地判斷自噬水平的高低。本實驗中，Apelin-13組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低，表明Apelin-13對腦缺血再灌注過程的自噬有顯著抑制作用。

綜上所述，Apelin-13可明顯減輕腦缺血再灌注損傷，保護大腦的功能。通過抑制細胞的自噬可能是其作用機制之一，但是自噬的發生是一個復雜的過程，其具體作用機制還有待于進一步的研究證實。

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①徐州醫科大學 江蘇 徐州 221002

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.005

收稿日期：（2016-03-29） （本文編輯：蔡元元）

*基金項目：國家自然科學青年基金項目（81302612）；江蘇省高校自然指導項目（15KJD180003）

通信作者：李周儒

The Effect of Apelin-13 on Mice after Middle Cerebral Artery Occlusion-Reperfusion Injury

KUAI Jin-xia，BAO Hai-jun，LI Zhou-ru，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（20）：018-021

【Abstract】Objective：To observe the effect of apelin-13 on the brain injury induced by middle cerebral artery occlusion-reperfusion（MCAO/R），and to explore the relationship between apelin-13 and autophagy in MCAO/R. Method：A total of 48 mice were randomly divided into sham，saline and apelin-13 groups.Firstly，mice s MCAO/R model was established using the suture’s method.After MCAO/R， Apelin-13 and saline groups were pretreated with an immediate injection of Apelin-13 and saline into the mice brain lateral ventricle.The effect of neurological deficit scores and the cerebral infarct volume was measured with TTC at 48h after MCAO/R.At last，to determine the role of Apelin-13 on the brain injury induced by MCAO/R，the autophagy associated proteins LC3 were also assessed with western-bloting.Result：Apelin-13 can significantly decreased neural dysfunction and cerebral infarct volume of mice after MCAO/R 48 h.Inadditionally，Apelin-13 also reduce the amount of protein LC3 expression and down-regulated protein LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰratio，at 24 h and 48 h after MCAO/R.Conclusion：Apelin-13 preconditioning has obvious protective effect on mice after MCAO/R，and the mechanism may possibly by suppressing neuron autophagy.

【Key words】Apelin-13； MCAO/R； Autophagy； LC3