異種源性脫細胞神經支架修復坐骨神經損傷后再生的可行性*

陳少紅季婉青侯博

異種源性脫細胞神經支架修復坐骨神經損傷后再生的可行性*

陳少紅①季婉青②侯博③

【摘要】目的：評價異種脫細胞神經支架修復大鼠坐骨神經損傷的療效。方法：以兔源性脛神經為原材料，通過萃取技術制備脫細胞神經支架；HE染色、甲苯胺藍染色、免疫組化（IHC）、掃描電鏡（SEM）、透射電鏡（TEM）檢測技術評價脫細胞效果；體內實驗部分采用坐骨神經離斷模型，按照移植物的不同，將SD大鼠隨機分為兩組：異種神經支架移植組（實驗組）、自體神經移植組（對照組），術后12周內，流式細胞術檢測大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+淋巴細胞含量，以判定機體免疫系統情況；通過神經功能測定及形態學手段評價10 mm缺損神經的修復效果。結果：支架內的細胞和髓鞘成分能夠徹底去除，基底膜管狀結構保留較為完整。術后1、4、12周時間點，實驗組大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+淋巴細胞含量與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。4周及12周后，兩組坐骨神經功能指數（SFI）比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；實驗組移植物內的再生軸突數量、再生髓鞘厚度方面與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論：異種神經脫細胞支架干預10 mm大鼠坐骨神經缺損，并不會引起機體系統性排斥反應，同時能夠有效促進損傷神經再生。

【關鍵詞】異種； 細胞外基質； 支架； 神經再生； 免疫排斥反應

First-author’s address：Clinic Department of the People’s Government of Guangdong Province，Guangzhou 510030，China

外周神經損傷后，自體神經移植是治療的“金標準”［1］，但因其來源匱乏，需要二次手術以及尺寸難以匹配等問題，極大地限制該種治療的臨床應用和推廣［2］。因此探尋一種安全、有效且易獲取的神經替代物就顯得尤為重要。異種神經脫細胞支架來源于其他物種的細胞外基質，除了具有天然細胞基質的性質外，最大的優點是該類支架取材方便，支架的尺寸大小可任意選取［3］。但基于物種間的差異，該類材料的安全性及有效性仍需進一步探討。本實驗中，筆者利用兔的脛神經制取脫細胞神經支架，嘗試修補大鼠10 mm坐骨神經缺損。術后12周內評估神經修復效果，以期尋找一種較為理想的神經修補材料。

1 材料與方法

1.1 材料 硫代甜菜堿10（SB-10），硫代甜菜堿16（SB-16），TritonX-200（均購自Sigma aldrich公司），過氧乙酸（Adamas-Beta），α-MEM（Gibco）、南美血清（Gibco），一抗：層粘連蛋白（LN）抗體（Rabbit anti-Laminin Sigma aldrich L9393；1∶800），纖維粘連蛋白（FN）抗體（Rabbit anti-Fibronectin Abcam ab23751；1∶500），神經絲蛋白-200（NF-200） 抗 體（Rabbit anti-neurofilament 200 Sigma aldrich N4142；1∶2000），anti-Rat CD3 PE（eBioscience 17-0030；1∶100），anti-Mou CD4 APC（invitrogen MR5105；1∶200），anti-Rat CD8a FITC（eBioscience 11-0084；1∶50），Alex flour 488 anti-rabbit（Jackson 711-545-152；1：1000），Alex flour 594 anti-rabbit （Jackson 111-585-003；1∶1500），Real Envision二抗檢測試劑盒（上海基因公司）；搖床（江蘇金壇），離心機（上海飛鴿），光學顯微鏡（Nikon-eclipse 80i，日本），透射電鏡（FEI TECNAI SPIRIT G2香港），掃描電鏡（FEI QUANTA 200，香港），冰凍切片機（Leica M750），解剖顯微鏡（Leica），超薄切片機（Leica）。

1.2 實驗動物及分組 本研究所涉及新西蘭成年兔及SD大鼠均由中山大學實驗動物中心提供［（使用許可證編號：SYXK（粵）2012-0083）］，并由中山大學附屬第三醫院倫理委員會批準。健康新西蘭成年兔3只，雌雄不限，體質量3～3.5 kg，用于獲取制備脫細胞支架的原材料；健康成年SD大鼠30只，雌雄不限，體量250～280 g，利用完全隨機分組法將動物分為實驗組和對照組，每組15只。手術過程于中山大學附屬第三醫院神經外科顱底實驗室完成。

1.3 方法

1.3.1 兔源性脫細胞神經支架的制備方案和檢測方法 分離兔兩側脛神經，手術顯微鏡下剝離表面的脂肪組織和血管，游離神經組織。按照下列步驟制備神經支架：（1）去離子水中浸泡6 h，期間換液3次；（2）將神經浸入125 mmol/L SB-10中，室溫震蕩12 h（90 r/min），去離子水漂洗3 h（0.5 h換液1次）；（3）0.14%TritonX 200和0.16 mmol/L SB-16混合溶液中室溫振蕩24 h，去離子水漂洗3 h（0.5 h換液1次）；（4）重復1～3步驟；（5）經上述處理過的神經于體積分數0.1%的過氧乙酸消毒6 h，無菌蒸餾水充分漂洗后，置于無菌PBS中4 ℃冰箱內保存備用。

1.3.2 支架形態學檢測 HE染色檢測脫細胞效果；LN（1∶800）、FN（1∶500）免疫組化染色證實支架的成分和結構；甲苯胺藍染色及透射電鏡檢測髓鞘去除程度；掃描支架觀察支架內部結構；NF-200免疫染色顯示軸突去除情況。

1.3.3 外周血淋巴細胞亞群分析 術前及術后1、4、12周，兩組大鼠通過尾靜脈分別收集外周血500 μL于抗凝管中。按照以下步驟進行流式檢測：（1）新鮮抗凝血，按1∶10的比例向抗凝管中加入紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，1100 r/min離心4 min后棄上清。繼以Buffer溶液重懸。（2）按合適濃度加入抗體（CD3-PE；1∶50、CD4-APC；1∶200、CD8-FITC；1∶50），避光孵育30 min。（3）每樣品管加入1.5～2 mL Buffer溶液，1100 r/min離心4 min后棄去上清。（4）每樣品管加入300 μL Buffer溶液重懸，上機檢測（BD FACS Calibur流式細胞儀）。1.3.4 造模方法 大鼠麻醉后（戊巴比妥鈉；腹腔注射），暴露右側坐骨神經，造成10 mm長的神經缺損。（1）實驗組：在解剖顯微鏡下（25倍視野），利用8-0尼龍線將支架與宿主的神經外膜縫合。（2）對照組：相同解剖位置切取10 mm長的坐骨神經后，將其翻轉后再吻合于原處，術后青霉素肌肉注射于手術切口周圍，預防感染。所有動物均在標準條件下飼養。

1.4 術后神經再生評價 術后1、2、4、12周對各組動物進行坐骨神經功能指數（Sciatic nerve function index，SFI）評價：設計長約1 m暗箱通道，鋪以記錄紙張，予大鼠雙側后腳涂墨水，驅趕其穿過通道，行走后，記錄紙上留有足印。每次取5～6對足印進行以下測量：足印長度（PLF）、足距寬度（TSF）、中間足趾寬度（ITF）；SFI=-38.3 PLF+109.5 TSF+13.3 ITF-8.8。SFI為0代表功能正常，-100代表功能完全喪失。12周后將移植物取出后行以下處理：40 g/L多聚甲醛溶液固定、脫水、包埋、切片（5 μm），NF-200（1∶2000）免疫組化觀察軸突生長情況；2.5 mL/L戊二醛前固定，10 mL/L鋨酸后固定，下行脫水后環氧樹脂包埋、聚合、半薄切片行甲苯胺藍染或經醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染后行透射電鏡檢測，Imagine-pro plus 6.0軟件分析再髓鞘化神經纖維的數量，髓鞘的厚度，軸突的直徑大小。

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，比較行重復測量資料的方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 手術傷口觀察 所有動物一般狀況良好，手術側肢體均有不同程度的趾甲萎縮，腳墊出現潰瘍在實驗組有2只，對照組有1只。術后12周，重新暴露手術區，移植物與周圍組織均有輕度粘連，兩組動物均未發現有移植物皺縮或崩解。

2.2 支架形態學檢測 HE染色顯示細胞核完全去除（圖1A）；甲苯胺藍染色及透射電鏡顯示致密的髓鞘結構完全去除（圖1B、D）；超微結構有輕微的變形，基底膜保留較為完整（箭頭所示）；掃描電鏡顯示支架內部為多孔狀立體通道結構（圖1C）；熒光免疫證實支架成分富含纖維粘連蛋白（圖1E）及層粘連蛋白（圖1F）；與正常神經（圖1G）相比，支架內部軸突神經絲蛋白（圖1H）已經完全去除。

2.3 外周淋巴細胞亞群分析結果 淋巴細胞亞群分析結果顯示，與術前相比，術后第1周，兩組大鼠外周血內CD3+、CD4+淋巴細胞及CD4+/CD8+均有不同程度升高，差異均無統計學意義（P＞0.05）；術后第4周CD3+、CD4+淋巴細胞及CD4+/CD8+較之前有所下降；術后第12周，兩組大鼠上述變量基本降至術前水平，比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。術后1、4、12周時間點，兩組間大鼠外周血CD3、CD4+、CD8+淋巴細胞含量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1～4。

圖1 異種來源的神經支架形態學檢測

表1 兩組術前外周淋巴細胞亞群分析（±s）

表1 兩組術前外周淋巴細胞亞群分析（±s）

組別 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+實驗組（n=15）72.55±3.11 56.42±4.23 42.01±3.19 1.54±0.27對照組（n=15）69.47±4.78 55.34±3.38 40.84±4.55 1.49±0.14 F值 0.68 1.33 0.21 11.46 P值 0.78 0.56 0.34 0.71

表2 兩組術后1周外周淋巴細胞亞群分析（±s）

表2 兩組術后1周外周淋巴細胞亞群分析（±s）

組別 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+實驗組（n=15）79.32±4.12 61.42±6.13 35.75±3.19 2.14±0.41對照組（n=15）76.34±6.47 59.71±4.21 32.55±3.28 1.99±0.32 F值 0.77 0.91 1.56 7.32 P值 0.19 0.27 0.73 0.44

表3 兩組術后4周外周淋巴細胞亞群分析（±s）

表3 兩組術后4周外周淋巴細胞亞群分析（±s）

組別 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+實驗組（n=15）73.33±2.23 55.41±3.73 40.13±5.56 1.63±0.23對照組（n=15）74.57±4.55 53.34±6.22 42.27±3.98 1.53±0.39 F值 0.79 1.49 1.21 9.88 P值 0.69 0.81 0.18 0.38

表4 兩組術后12周外周淋巴細胞亞群分析（±s）

表4 兩組術后12周外周淋巴細胞亞群分析（±s）

組別 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+實驗組（n=15）69.19±5.67 57.45±5.61 39.01±3.19 1.48±0.38對照組（n=15）67.77±2.84 53.57±6.11 41.73±3.36 1.55±0.22 F值 1.67 0.56 0.33 5.21 P值 0.30 0.47 0.55 0.18

2.4 功能評價 12周恢復期內，兩組大鼠均有不同程度的功能恢復。術后第1周，各組SFI值均在-98左右，2周后兩組均有不同程度升高；4周及12周后，實驗組SFI分別為（-90.6±2.8）、（-82.6±1.4），對照組分別為（-87.7±3.5）、（-77.8±1.5），兩組4周及12周SFI值比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 術后12周內兩組SFI評價

2.5 軸突及髓鞘再生評價 術后12周，重新暴露手術區，移植物與周圍組織均有輕度粘連（圖3A）；實驗組移植物內有NF-200陽性軸突通過（圖3B），軸突呈現極性排列，與支架縱行絲狀結構伴行，與遠端神經內軸突形成聯系，但離遠端縫線1.5 cm處遠處，軸突數量變少，直徑變細（圖3C）。甲苯胺藍染色及TEM評價（圖4）：實驗組移植物內 再生軸突數量（圖4C、D、E）每一個高倍鏡視野（1000倍）下為（80±7）個，但與對照組（80±5）個（圖4A、B、E）比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；移植物內再生髓鞘厚度方面（圖4F），實驗組為（0.53±0.12）μm，與對照組（0.52±0.08）μm比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 NF-200熒光染色顯示實驗組軸突再生情況（術后12周內）

圖4 術后12周甲苯胺藍及投射電鏡下觀察大鼠移植物內軸突再生情況

3 討論

近年來，組織工程技術在神經修復領域的應用越來越廣泛，脫細胞神經支架的研究也逐步走向臨床階段，雖然其促進神經修復的效果受到諸多學者的認可，但是來源匱乏直接影響其日后在臨床上的應用［4-5］。同種異體神經支架一般來源于截肢的肢體或者尸體，和自體移植相比有諸多優勢，但是由于某些社會習俗和宗教因素的影響，原材料的獲取受到很大限制，因此需要尋找一種更加方便、有效的神經替代物。

去細胞支架來源于天然外周神經組織，經過處理，去除大部分抗原成分比如細胞和髓鞘成分，而保留完整的細胞外基質結構（ECM），研究表明ECM能夠為增殖的雪旺氏細胞（SC）提供黏附和導向支持，這對后續形成bunger帶至關重要，同時也為軸突再生鋪平道路［6-9］；另一方面研究認為ECM富含很多蛋白，像膠原蛋白（CollagenⅠ及Ⅳ型），纖維粘連蛋白（Fibronectin，FN），層粘連蛋白（Laminin，LN）等。這些成分通過影響軸突的再生速度和方向來左右神經再生的效果［10-11］。通過處理及后期檢測，筆者制備的去細胞神經支架細胞及髓鞘成分完全去除，基底膜結構保存完整，富含LN、FN成分。

對異種移植物的應用最大的憂慮就是其生物安全性。理論上來說，利用萃取方法可以完全去除抗原成分，但實際上操作起來異常困難。有實驗表明通過常見的萃取技術制備的去細胞支架依然可以檢測到300 bp殘余的DNA［12-13］，但此殘余量理論上不足以導致嚴重的排斥反應，有學者發現，實際DNA殘余量遠低于上述水平［14］。另外有觀點認為在哺乳動物各物種間，ECM氨基酸的組成順序具有高度一致性［15-16］，這也是異種ECM不會引發排斥反應的重要原因之一；ECM成分所誘導的宿主淋巴細胞反應通過Th1和Th2這兩種途徑，前者和促炎因子有關，介導組織免疫排斥；后者抑制炎癥的產生，介導免疫耐受。有實驗證明異種細胞外基質成分所涉及到的反應僅限于Th2途徑［17］。這些理論是異種脫細胞支架體內應用的強有力支持。在未給予免疫抑制劑的情況下，本實驗中所有動物均沒有發現全身性免疫排斥反應。雖然移植術后1周時，實驗組動物外周血CD4/CD8比例有所提高，但考慮為手術切口局部炎癥反應造成。動態分析在第4周和12周，該比例逐漸下降至術前水平。這些變化同時發生在對照組中，兩組結果比較差異并無統計學意義（P＞0.05），這證實兔源性異種神經支架移植到體內并未干擾大鼠機體的免疫系統。

目前外周神經支架有多種商業化產品，大部分為人工合成材料（PLGA，殼聚糖等）構成。因缺乏生物活性，修復效果欠佳；形狀及尺寸較單一，很難保證個體化匹配［18］，臨床應用價值還有待提高。脫細胞神經支架可能能夠解決上述顧慮，但該類支架臨床應用較少，縱然近年來很多數據證實其臨床應用的價值［19-20］，但原材料的來源依然是個不容忽視的問題，因此異種脫細胞神經支架的價值就顯得更為突出。在本實驗中，筆者使用兔來源的神經支架修復大鼠坐骨神經缺損，取得較為理想的效果，這證實異種支架具有良好生物安全性及作用有效性。極有可能將來廣泛應用到臨床。雖然其他物種間未測試，但是本研究結果為異種脫細胞材料的臨床應用提供實驗參考。

綜上所述，本研究認為，兔源性脫細胞神經支架修復大鼠10 mm長的神經缺損，能夠達到自體移植修復水平，同時并未引起明顯的全身性排斥反應，表明具有較為安全的生物學特性，為異種脫細胞神經移植物將來應用到臨床提供實驗依據。

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［20］ Junka R，Yu X.Novel Acellular scaffold made from decellularized schwann cell sheets for peripheral nerve regeneration［J］.Regen Eng Transl Med，2015，1（1）：22-31.

①廣東省人民政府機關門診部 廣東 廣州 510030

②廣州市婦女兒童醫療中心

③中山大學附屬第三醫院

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.007

收稿日期：（2016-06-01） （本文編輯：蔡元元）

*基金項目：廣東省自然科學基金（2014A030313189，2014A030310408）；廣東省科技計劃項目（2014A020211013，2015A020212016，2016A020214007）

通信作者：侯博

The Feasibility of Xenogeneic Acellular Nerve Scaffold to Repair Rat Sciatic Nerve Defect Regeneration/CHEN Shao-hong，JI Wan-qing，HOU Bo.//Medical Innovation of China，2016，13 （20）：027-032

【Abstract】Objective：To evaluate remodeling effect of xenogeneic acellular nerve scaffold in a rat sciatic nerve defect model.Method：Scaffolds derived from rabbit tibial nerves were processed by extractive method，and results were monitored by HE，toluidine blue，immunohistochemistry， SEM，TEM.SD rats were randomly divided into two groups：xenogeneic acellular nerve scaffold group（experimental group） and autograft （control group）group.During 12 weeks postoperatively，the amount of CD3+，CD4+，CD8+in blood were measured to evaluate the systematic immunologic function.Regenerative results were determined by SFI test，and histological examination.Result：Cell component and myelin sheath were completely removed and intact basal lumina tubes were persistent.During observation，all animals had no sign of immunological rejection systematically，grafts bridged well without any disintegration.In the experimental group，the amount of CD3+，CD4+，CD8+in blood were not different with the control groups at 1，4，12 weeks postoperatively（P＞0.05）.Statistical analysis revealed that experimental group had no statistically significant differences between the experimental group and control group on aspect of SFI at 4，12 weeks（P＞0.05）.There had no statistically significant differences between the experimental group and control group on axon number and myelin sheath depth（P＞0.05）.Conclusion：Xenogeneic acellular nerve scaffold may be a promising approach in repairing peripheral nerve defect.

【Key words】Xenogeneic； Extracellular matrix； Scaffold； Nerve regeneration； Immunological rejection