替莫唑胺誘導的耐藥細胞系U251/TR的構建及衣霉素對其耐藥性的逆轉作用*

楊艷茹　劉景景　孫利利　趙　晶　王　浩　馬　健　王德才

(泰山醫學院藥學院，山東 泰安　271016)

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替莫唑胺誘導的耐藥細胞系U251/TR的構建及衣霉素對其耐藥性的逆轉作用*

楊艷茹劉景景孫利利趙晶王浩馬健王德才

(泰山醫學院藥學院，山東 泰安271016)

摘要：目的構建替莫唑胺(temozolomide，TMZ)耐藥細胞系U251/TR，并觀察衣霉素(tunicsmycin,Tm)逆轉對替莫唑胺耐藥細胞系U251/TR 細胞的作用。方法采用替莫唑胺對U251細胞進行體外分步誘導，產生耐藥的U251/TR 細胞系；CCK-8法檢測TMZ對U251和U251/ TR 細胞增殖抑制作用，計算半數抑制濃度(IC50)，得到U251/TR細胞系對TMZ的耐藥指數(RF)；采用細胞集落法確定U251/TR的耐藥性；將Tm聯合TMZ作用于U251/TR細胞系，采用CCK-8法分別測定不同給藥組細胞的增殖抑制作用。結果通過體外分步誘導法成功地建立了對TMZ具有穩定耐藥性的U251/TR細胞株。CCK-8法檢測結果顯示，U251/TR的耐藥指數約為5.2；細胞集落法確定誘導過程中的U251/TR的耐藥性為1.2～3倍。Tm和TMZ聯合應用呈協同效應。結論成功建立了由TMZ誘導的人腦膠質瘤耐藥細胞株U251/TR。Tm聯合TMZ能顯著逆轉U251/TR 細胞系的耐藥性。

關鍵詞：替莫唑胺；腦膠質瘤；耐藥性；衣霉素

腦膠質瘤是最常見的腦腫瘤[1]，目前多采取手術切除和術后輔以化療及放療的綜合治療方案，烷化劑替莫唑胺(temozolomide，TMZ)容易通過血腦屏障，是目前最有效的治療腦膠質瘤的化療藥物[2]。但是膠質瘤細胞對TMZ具有原發或繼發性耐藥作用，這嚴重制約了膠質瘤的治療效果[3]。衣霉素(tunicamycin，Tm )是天然的抗生素，可通過抑制蛋白糖基化誘導內質網應激[4]，近年來研究發現Tm可誘導多種腫瘤細胞凋亡[5-6]。本研究擬建立TMZ耐藥細胞系U251/TR細胞模型，通過研究Tm聯合TMZ 逆轉U251/TR細胞耐藥的作用，嘗試在體外探討這兩種藥物聯合應用作為膠質瘤化療方法的可行性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 替莫唑胺(TMZ，美國Sigma公司)，衣霉素(Tm，比利時百靈威公司)，二甲基亞砜(DMSO，北京Solarbio公司)，CCK-8(日本同仁化學研究所)，DMEM培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國invitrogen公司)。

1.1.2 細胞人腦膠質瘤細胞U251購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2方法

1.2.1U251細胞的復蘇、傳代把凍存的人膠質瘤細胞株U251復蘇后，培養于10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100 U/ml的DMEM培養液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養，待細胞長至80%左右時以0.125%胰蛋白酶消化，按1∶3接種傳代，經2～3次傳代后至指數生長期進行實驗。

1.2.2細胞耐藥分步誘導將處于對數生長期的U251細胞傳代后，以6000/孔的密度接種在96孔板里，測定TMZ對U251細胞的半數抑制濃度(IC50)，為93.7 μg/ml。以IC50的1/150 TMZ，即0.625μg/ml加入到細胞培養液中繼續培養。待細胞生長穩定后，開始倍增藥物誘導劑量，依次為1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml、160 μg/ml，每個劑量保持培養14d左右。至第6個月末可誘導出對TMZ具有5倍耐藥的細胞系，并命名為U251/TR。

1.2.3 細胞集落法確定耐藥性取TMZ 80 μg/ml誘導劑量時的細胞進行耐藥性檢測。將U251/IR細胞和U251細胞以200個/ml接種于96孔培養板中，24h后分別加入TMZ 20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml。兩種細胞均同時設無藥對照組以便計算給藥組細胞集落形成相對率。加藥后連續培養15d，棄培養液，以0.5%亞甲蘭乙醇染色計數細胞集落，比較兩組細胞間的細胞集落形成相對率。

1.2.4CCK-8法檢測U251/TR對TMZ的耐藥指數分別將對數生長的U251/TR細胞和U251細胞接種于96孔細胞培養板，每種藥物設3個復孔。過夜培養后加入TMZ，培養24h。棄上清，每孔加入10 μl的CCK-8培養1～2h后，經TIKEN酶標儀測定每孔在450 nm波長下的OD值。抑制率=(對照組平均OD值-用藥組平均OD值)/對照組平均OD值×100%，由直線回歸方程計算出不同藥物濃度兩組細胞各自的半抑制濃度(IC50)，按以下公式得出U251/I'R的耐藥指數(RI)，RI=IC50(U251/TR)/I C50(U251)。

1.2.5 CCK-8法檢測Tm聯合TMZ對U251/ TR細胞增殖抑制作用培養U251/ TR 細胞株，分為3組：Tm組、TMZ組、Tm聯合TMZ 組，以6000個/孔接種到96 孔板，待細胞貼壁后(18～24h)，加入藥物，其中Tm組加入不同濃度的Tm (1μM，5μM )，TMZ組加入不同濃度的TMZ (0.5mM，1mM，1.5mM ), Tm聯合TMZ組為分別加入不同濃度的Tm和TMZ。藥物作用24h后，CCK-8檢測細胞增殖情況，具體方法同上。

1.2.6統計分析實驗數據經Graphpad prism 4.0 進行統計處理，數據用均數±標準差表示，組間差異用方差分析。以P≤0. 05為差異有統計學意義。用金正均法計算Q值來評價藥物合用對細胞增殖是否有協同作用[7]，Q=E(a+b)/(Ea+Eb)-Ea×Eb，E(a+b)為合用抑制率，Ea和Eb分別為A藥和B藥的抑制率。Q值>1.15為協同增效，0．85～1.15相加，<0．85為拮抗。

2結果

2.1TMZ 誘導的U251/ TR膠質瘤細胞株耐藥性測定

2.1.1檢測U251/TR 細胞株的耐藥指數(RI)以TMZ的濃度對數值為橫坐標，腫瘤細胞抑制率為縱坐標，繪制抑制率曲線，并求出半數抑制濃度(IC50)，U251細胞IC50值為93.75μg/ml(0.49 mM)，U251/ TR 細胞IC50值為487.6 μg/ml(2.5mM)，計算得出U251/TR 的耐藥指數(RI)約為U251的5.2倍(圖1，表1)。

圖1　不同濃度TMZ對U251和U251/TR細胞存活率的影響

DrugIC50(mM)U251U251/TRRIP值TMZ0.482.55.2<0.05

2.1.2細胞集落法確定U251/ TR 的耐藥性結果表明，不同濃度的TMZ處理的U251/ TR 細胞集落相對率均明顯高于親本U251細胞(P<0. 05)，U251/ TR 是U251細胞的1.2～3倍(圖2)，U251/ TR細胞具有相對明顯的耐藥性。

圖2　不同濃度TMZ處理的U251和U251/TR細胞相對集落形成率(*P<0.05,**P<0.01)

2.2Tm對于TMZ的耐藥逆轉Tm對U251/ TR 細胞IC50值為7.6 μM ，本實驗選擇(1μM，5μM ) Tm和(0.5mM ，1mM ，1.5mM )TMZ聯合給藥，結果發現藥物聯合給藥作用24h對U251/ TR細胞增殖抑制率大于兩藥單獨使用(表2，圖3)。金正均法計算的Q值均>1.15，表明兩藥合用產生的作用遠大于兩藥單獨相加，產生協同效果(表3)。

表2　Tm和TMZ聯合給藥對U251/TR細胞存活率的影響

注：n=4，表內值為細胞存活率(%)。

圖3　Tm和TMZ聯合給藥對U251/TR細胞存活率的影響(*P<0.05,**P<0.01)

Tm(μM)TMZ(mM)0.511.511.6951.5011.41451.5221.4461.426

3討論

腦膠質瘤是最常見的中樞神經系統腫瘤，由于其呈浸潤性生長和常累及腦的重要功能區，手術很難做到徹底清除，且復發率高，因此術后的化療是重要的治療措施，尤其隨著新型化療藥物的出現和新化療方案的探索，化療療效有了很大的提高[1]。臨床實踐證明烷化劑TMZ有良好的抗膠質瘤活性，然而，耐藥性的產生限制了TMZ的化療效果，是造成膠質瘤化療失敗的主要原因[2-3]，因此在體外建立對TMZ耐藥的膠質瘤細胞株，對于探討逆轉膠質瘤耐藥的有效策略，提高膠質瘤的化療效果有重大臨床意義。Tm是內質網應激誘導劑，通過抑制蛋白糖基化引起內質網應激[4]。近年來的研究發現，Tm對多種腫瘤細胞有抑制增殖和誘導凋亡的作用，比如，Tm通過增加細胞內ROS的產生而誘導U973組織淋巴瘤細胞凋亡[5]，通過激活線粒體凋亡途徑誘導胃癌細胞SGC-7901和BGC-823凋亡[6]。同時，有研究報道Tm可增強赫賽汀抗乳腺癌的活性[8]，還可增加內質網應激水平，促進順鉑誘導HeLa細胞發生凋亡[9]。但是Tm對膠質瘤細胞的直接生物學作用和對TMZ耐藥的影響尚不清楚。

臨床研究表明，腫瘤細胞的耐藥倍數一般約2倍左右，本實驗成功地誘導出了人腦膠質瘤耐藥細胞株U251/TR，與親本細胞U251相比，U251/TR對TMZ的耐藥指數是5.2倍，比較接近臨床上的實際耐藥現象。在膠質瘤耐藥模型U251/TR細胞上，聯合給予Tm和TMZ，觀察Tm對TMZ的耐藥逆轉情況，結果發現TMZ 1μM和5μM能明顯增強U251/TR細胞對TMZ的敏感性，產生逆轉細胞耐藥的作用。Tm的抗腫瘤作用可能與其抑制增殖、誘導內質網應激性凋亡及其他程序性死亡途徑有關，但其逆轉U251/TR細胞耐藥的機制尚不明確，有待進一步研究。

參考文獻：

[1]Goodenberger ML, Jenkins RB. Genetics of adult glioma[J].Cancer Genet, 2012,205(12):613-621.

[2]Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J]. N Engl J Med,2005，352(10):987-996.

[3]Neyns B, Tosoni A, Hwu WJ, et al. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects[J].Cancer, 2010,116(12):2868-2877.

[4]Carlisle RE, Brimble E, Werner KE, et al. 4-Phenylbutyrate inhibits tunicamycin-induced acute kidney injury via CHOP/GADD153repression[J].PLoS One,2014,9(1):84663.

[5]Lim EJ, Heo J, Kim YH. Tunicamycin promotes apoptosis in leukemia cells through ROS generation and down-regulation of survivin expression[J]. Apoptosis, 2015,20(8):1087-1098.

[6]吳亞歐，張林杰，張旭東，等. 高表達Mcl-1對衣霉素誘導胃腺癌細胞凋亡的影響[J]. 安徽醫科大學學報，2010，30(1)：20-23.

[7]金正均. 合并用藥中的相加[J].中國藥理學報，1980，1(2)：70-76.

[8]Han X, Zhang X, Li H, et al. Tunicamycin enhances the antitumor activity of trastuzumab on breast cancer in vitro and in vivo[J].Oncotarget, 2015,6(36):38912-38925.

[9]徐冶，李質馨，曹慧玲，等. 衣霉素對順鉑誘導人宮頸癌細胞凋亡的影響[J]. 解放軍醫學雜志， 2013， 38(4)：283-287.

*基金項目：山東省自然科學基金(ZR2011HQ055)，國家自然科學基金(81302202，81441111)。

作者簡介：楊艷茹(1990—)，女，碩士研究生，研究方向：腫瘤藥理學。 通訊作者：王德才(1962—)，男，教授，E-mail: dcwang@tsmc.edu.cn。

中圖分類號：R965

文獻標識碼：A

文章編號：1004-7115(2016)07-0721-03

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.07.001

(收稿日期2016-03-08)

Establishment of drug-resistance U251/TR cell lineinduced by temozolomide and reverse effects of tunicamycin

YANG Yan-ru LIU Jing-jing SUN Li-li ZHAO Jing WANG Hao MA Jian WANG De-cai

(Taishan Medical University, Taian 271016,China)

Abstract:Objective: To establish drug-resistance U251/TR cell line with timozolomide(TMZ), and to study the effect of tunicamycin(Tm) on reversing temozolomide resistance in glioma cells. Methods: Drug resistance of U251glioma cells was induced by the stepwise revulsion with TMZ. The proliferative inhibition effect of TMZ on U251,U251/ TR cell line and IC50value were evaluated by CCK-8 method.The drug resistance and resistance index (RI) were determined by cell colony experiment and CCK-8 assay. The combination of Tm(1μM,5μM) and TMZ (0.5mM,1.5mM,5mM) on U251/TR cells were tested by CCK-8 method. Results: U251/ TR cell line of drug resistance was successfully induced by TMZ with step wise revulsion method in 6-month culture. The cell cloning experiment demonstrated that the colony-foming efficency of U251/TR cells was 1.2～3times that of U251cells. The drug resistance index was about 5.2in U251/TR cell line assayed by CCK-8 method. Combined Tm and TMZ treatment showed a synergistic effect in U251/TR cell (Q>1.15). Conclusion: The drug resistant U251/TR cell line was established successfully. Combination of Tm with TMZ could reverse durg resistance of U251/TR cells.

Key words:timozolomide; glioma; drug-resistance; tunicamycin