結核分枝桿菌融合抗原38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c在結核病血清學診斷中的應用價值*

郭洪娜

(臨沂市沂水中心醫院，山東 沂水　276400)

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結核分枝桿菌融合抗原38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c在結核病血清學診斷中的應用價值*

郭洪娜

(臨沂市沂水中心醫院，山東 沂水276400)

摘要：目的探討結核分枝桿菌融合抗原38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c在結核病血清學中的診斷價值。方法以痰涂片、痰培養和標準試劑盒作為對照，應用化學發光法(chemiluminescence immunoassay，CLEIA)檢測結核病組、非結核呼吸系病組、健康對照組血清標本中38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗體水平，評價其在結核病血清學中的診斷價值。結果①肺結核病組38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c的抗體水平(143621.0±23231.7，179731.1±16342.1)明顯高于非結核呼吸疾病組(27417.5±2371.8，32066.2±3310.9)和健康對照組(35262.9±5764.2，22765.5±3695.7)，(P<0.05)。②38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c檢測抗結核抗體的敏感度(69.0%，72.0%)、高于痰培養(21.0%)、38 kD(20.0%)、16 kD試劑盒(26.0%)，(P<0.05)。③38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c檢測抗結核抗體的特異度(85.4%，83.8%)高于38kD(61.1%)、16kD試劑盒(50.0%)，(P<0.05)。④聯合應用38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c融合抗原檢測抗結核抗體的敏感度為89.0%，明顯高于38kD- Rv1419(69.0%)、16kD- Rv2041c(72.0%)，(P<0.05)。結論結核分枝桿菌融合抗原38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c在結核病的血清學診斷上均具有較高的敏感度和特異度，其聯合應用，能夠提高抗結核抗體檢測的敏感度。

關鍵詞：38kD-Rv1491；16kD-Rv2041c；化學發光酶免疫法；血清學診斷

目前世界上現存的傳染病中，結核病(tuberculosis，TB)的傳播流行是非常廣泛、嚴重的，并且嚴重危害著人民群眾的身體健康，導致罹患傳染病的人群致殘、致死[1]。目前結核病實驗室診斷的主要方法有細菌學、血清學、分子生物學等，其中血清學診斷因所需的費用低、實驗方法簡單而占有重要的地位，但也有不足之處：特異性抗體的檢測敏感度不高，一種抗原只能檢出部分結核感染者，用單個抗原進行檢測，其結果遠不能滿足臨床工作的需求等。所以多個抗原融合或者聯合應用就成了今后血清學診斷的主要研究方向。在本研究中應用化學發光酶免疫法檢測230份血清標本中抗38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c的抗體水平，為結核病血清學診斷提供更好的抗原選擇。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象(1)肺結核病組：2012年9月至2015年4月在沂水中心醫院傳染病科治療的100例患者，全部按照結核病診斷標準[2]確診為肺結核，其中52例男性，48例女性，平均年齡為(42±12)歲。(2)非結核呼吸疾病組：同期在呼吸內科治療的90例非結核呼吸疾病患者，排除肺結核，46例男性，44例女性，平均年齡(38±20)歲。(3)健康對照組：40例健康體檢者均來源于同期在體檢中心查體的人員，無結核病感染史，無呼吸道疾病。22例男性，18例女性，平均年齡為(39±15)歲。

1.1.2主要試劑與儀器38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗原購自軍事醫學科學院；16kD、38kD、16kD+38kD結核分枝桿菌抗體檢測試劑盒分別購自于廣州建侖、南京大淵、上海奧普生物醫藥有限責任公司；化學發光儀為北京科美東雅發展有限公司；BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養儀為BD公司。

1.2方法

1.2.1痰涂片和痰培養嚴格按《結核病診斷實驗室檢驗規程》進行操作。

1.2.2用38kD、38kD+16kD、16kD試劑盒(膠體金法)檢測肺結核病組、非結核呼吸疾病組血清標本中的抗結核抗體，嚴格按照試劑說明書操作。

1.2.3抗38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗體水平檢測(1)包被抗原：用抗原包被液將38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c分別稀釋至12.5、6.25μg/ml，每孔加樣100 μl，留空白對照孔(只加抗原包被液)，振蕩混勻，置4℃過夜。(2)洗板： 5次，每次5min。(3)封閉：每孔加150 μl封閉液混勻，37℃溫育60 min；(4)洗板： 5次，每次5min。(5)加待檢樣品：每孔加100 μl用封閉液按1∶20稀釋的血清標本，混勻，37℃溫育60 min。每個樣本做2個平行孔。同時設空白、陰性及陽性對照，空白孔內只加抗原包被液；陰性孔內加確診為非結核呼吸疾病患者血清，陽性孔內加38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗原陽性的血清標本。(6 )洗板：5次，每次5min。(7)加入羊抗人IgG：將HRP標記的羊抗人IgG抗體用封閉液稀釋至1∶10000，混勻，每孔加樣100μl，37℃溫育60 min。(8)洗板：5次，每次5min。(9)加入底物液：每孔加100 μl新鮮配制的底物溶液，立即放入化學發光儀。(10)測定發光值：將反應完全的酶標板放入發光儀中，讀取發光值，取兩孔平均值作為最終結果。(11) 繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC曲線)。

1.3敏感度與特異度的計算公式敏感度=真陽性人數/(真陽性人數+假陰性人數)×100%。特異度=真陰性人數/(真陰性人數+假陽性人數)×100%

2結果

2.1各組血清標本中38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗體水平見表1。肺結核病組38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗體水平明顯高于非結核呼吸疾病組和健康對照組，P<0.05；健康對照組與非結核呼吸疾病組相比較無明顯差異，P>0.05。

表1　各組血清標本中抗38kD- Rv1419，

2.238kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗體的ROC曲線分析見表2，圖1，圖2。

38kD-Rv1419抗體的ROC曲線下面積為0.842，把特異度為90%時的抗38kD- Rv1419抗體的化學發光值69000作為結核病診斷的臨界值，100例肺結核病患者中69例陽性，敏感度為69.0% (69/100)；90例非結核呼吸疾病患者中13例陽性，特異度為85.6% (77/90)。40例健康者中陽性6例，特異度為85.0% (34/40)。總特異度為85.4% (111/130)。

16kD- Rv2041c抗體的ROC曲線下面積為0.857，以特異度為90%時的抗16kD- Rv2041c抗體的化學發光值49000為診斷結核病的臨界值，100例肺結核病患者中，72例陽性，敏感度為72.0%(72/100)；90例非結核呼吸疾病患者中，16例陽性，特異度為82.2%(74/90)。40例健康者中5例陽性，特異度為87.5%(35/40)。總特異度為83.8%(109/130)。

表2　抗38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c的抗體ROC曲線分析表

95%可信區間均未包含0，曲線下面積有統計學意義

圖1　抗原38kD- Rv1419CLEIA檢測的ROC曲線圖

圖2　抗原16kD- Rv2041cCLEIA檢測的ROC曲線圖

2.3338kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗體的測定和痰涂片、痰培養及38kD、38kD+16kD、16kD 試劑盒檢測結果的比較，見表3。100例肺結核的患者中，38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c檢測的敏感度明顯高于痰培養法、38kD試劑盒和16kD試劑盒，P<0.05；與38kD+16kD試劑盒比較差無明顯異，P>0.05。90例非結核的呼吸疾病患者中，檢測的特異度明顯高于38kD試劑盒和16kD試劑盒，P<0.05；與38kD+16kD試劑盒比較，無明顯差異，P>0.05。

2.438kD- Rv1419、16kD- Rv2041c兩種抗原聯合檢測的臨床價值見表4。將38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c兩種抗原聯合進行檢測，其在診斷結核病上的敏感度為89.0%(89/100)，明顯高于38kD- Rv1419(69.0%，69/100)、16kD- Rv2041c(72.0%，72/100)，P<0.01。38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c兩種抗原聯合進行檢測的特異度為82.3%(107/130)，與38kD- Rv1419(85.4%, 111/130)、16kD- Rv2041c(83.8%, 109/130)相比，無顯著差異，P>0.05。從而可以看出這兩個抗原聯合應用能夠明顯提高結核抗體檢測的敏感度，而對特異度沒有影響。

表3　38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c和痰涂片、痰培養及試劑盒檢測結果的比較

表4　38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c兩種抗原聯合檢測的臨床價值

3討論

結核病的臨床診斷由于結核抗原多而復雜，所以結核病患者的抗體譜也呈現多樣性。Alito等[3]用10種重組結核分枝桿菌蛋白抗原檢測結核患者血清中的特異性結核抗體，結果顯示近90%的患者血清中至少存在一種結核抗體，抗體在體內表達的數量、種類及水平可以隨患者的免疫背景、疾病的不同階段以及結核分枝桿菌菌株的不同而不同[4]。結核病患者的抗體反應是針對多種結核抗原的，任何一種抗原都無法檢測結核病患者血清中所有的結核抗體，因此應用多種抗原進行聯合檢測，在保證特異性的基礎上有助于提高診斷的敏感性[5]。

38kD蛋白為結核分枝桿菌特異抗原，可引起機體的體液和細胞免疫，是主要免疫原，用于結核病血清學診斷，檢測的敏感度和特異度均較高，是迄今為止作為單項診斷結核最好的抗原，也是目前商品化試劑盒中使用最廣泛的抗原之一。研究報道該抗原檢測的敏感度為16% ～80%[6]。Rv1419是一個T細胞抗原，有較好的免疫原性，可刺激單個核細胞產生大量的IFN-γ。在本研究中我們把38 kD、Rv1419這兩種蛋白進行融合，形成了新的蛋白抗原，發現其在結核病血清學診斷中的敏感度和特異度分別為69.0%、85.4%，均高于單個抗原檢測，可以作為結核病血清學診斷的備選抗原之一。

很多研究表明，16kD抗原是一種不管在結核分枝桿菌穩定生長期還是在缺氧期都占優勢的蛋白[7]。有關學者[8]通過研究發現16kD抗原可以在結核病發病早期就能夠檢測出來。有關研究報道[9-11]，應用酶聯免疫吸附法檢測16kD抗原在診斷結核病的敏感度為23.5%～68.1%，特異度為69.5%～89.1%，和 38kD抗原聯合檢測的敏感度達到49.02%～70.1%，特異度為70.3%～82.0%。Rv2041c抗原是一種分泌蛋白，分子量約為30 kD，在肺結核患者的肺部高表水平達。對滲出期肺結核患者的痰液進行檢測，可以查及該蛋白升高，Rv2041c抗原可以刺激宿主發生強烈的抗原抗體反應[12]。有關研究[13]發現結核分枝桿菌的毒力越高，抗Rv2041c的抗體滴度就越高。國內學者[14]通過研究發現Rv2041c檢測結核病的敏感度為30.2%～50.1%。我們把這兩種蛋白融合成一個新的蛋白抗原，發現融合抗原具有較好的免疫原性，其在結核病血清學診斷中的敏感度和特異度分別為72.0%、83.8%，高于單個抗原檢測，也可以作為結核病血清學診斷的備選抗原。

在100例肺結核病患者中，38kD-Rv1419、16kD-Rv2041c檢測的敏感度分別為69.0%、72.0%，明顯高于痰培養(21.0%)、38kD試劑盒(20.0%)、16kD試劑盒(26.0%)，P<0.01；低于38kD+16kD(74.0%)試劑盒，但無明顯差異，P>0.05。38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗原檢測抗結核抗體的特異度分別為85.4%、83.8%，顯著高于38kD試劑盒(61.1%)、16kD(50.0%)；低于38kD+16kD(88.9%)，但無顯著差異，P>0.05。

對以上結果進行分析，我們可以知道結核分枝桿菌融合抗原38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c在診斷結核方面的價值遠遠超過結核病的細菌學檢查，并且明顯較目前臨床上應用比較廣泛的38kD、16kD抗體試劑盒更具有優勢。但仍然達不到WHO所提出的要求。

我們以ROC曲線中特異度為90%時的38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c抗體的化學發光值為診斷結核病的界限值，將這兩種結核分枝桿菌融合抗原聯合應用檢測抗結核抗體，我們發現其敏感度(89.0%)得到了大幅度的提高，其特異度卻無明顯降低(82.3%)。我們進一步分析其原因，可能是因為這兩種結核分枝桿菌融合抗原含有多種結核分枝桿菌特異性抗原決定簇。

通過以上研究結果，我們可以看出結核分枝桿菌融合蛋白38kD- Rv1419、16kD- Rv2041c都有非常高的免疫原性分別將其用于結核病的血清學診斷上均具有較高的靈敏性及特異度，將這兩種結核分枝桿菌融合抗原聯合以后，能夠較好的提高結核病診斷的陽性率，對特異度沒有影響，這兩種結核分枝桿菌融合蛋白可以應用到結核病的臨床診斷中去。

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*作者簡介：郭洪娜(1978—)，女，本科，主管技師，從事臨床檢驗工作。

中圖分類號：R446.11+2

文獻標識碼：A

文章編號：1004-7115(2016)07-0738-04

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.07.006

(收稿日期2016-03-07)

The application value of fusionantigen 38kd-rv1419, 16kd-rv2041c of mycobacterium tuberculosis in the serological diagnosis of tuberculosis

GUO Hong-na

(Dept. of Clinical Laboratory, Yishui Central Hospital of LinYi City, Yishui 276400, China)

Abstract:Objective: To study the application value of fusion antigen 38kD-Rv1419, 16kD- Rv2041c of mycobacterium tuberculosis in the serological diagnosis of TB. Methods: With sputum smear and sputum culture and standard kit as a control, the IgG level of 38kD-Rv1419 and 16kD-Rv2041c in serum of TB group and non-TB respiratory disease group and health control group were detected by Chemiluminescence immunoassay, in order to study its value in serological diagnosis of TB. Results: ① Antibody level of 38kD-Rv1419 and 16kD-Rv2041c in serum of TB group (143621.0±23231.7, 179731.1±16342.1) were obviously higher than that in non-TB group(27417.5±2371.8, 32066.2±3310.9) and health control group (35262.9±5764.2, 22765.5±3695.7), (P<0.05). ② The sensitivity of 38kD-Rv1419(69.0%), 16kD- Rv2041c(72.0%) was higher than that of using sputum culture (21.0%), 38kD kit (20.0%) and 16kD kit (26.0%), (P<0.05). ③ The specificity of 38kD- Rv1419 (85.4%), and 16kD-Rv2041c(83.8%)was higher than that of 38kD kit(61.1%) and 16kD kit(50.0%), (P<0.05). ④ The sensitivity of fusion antigen 38kD-Rv1419 combined with 16kD-Rv2041c was 89.0%, which was higher than that of 38kD-Rv1419 (69.0%), and 16kD-Rv2041c (72.0%), (P<0.05). Conclusion: The sensitivity and the specificity of the fusion antigen 38kD-Rv1419 and 16kD-Rv2041c are high in serological diagnosis in TB, and the sensitivity of 38kD-Rv1419 plus 16kD-Rv2041c is increased in TB dignosis.

Key words:38kD-Rv1491; 16kD-Rv2041c; chemiluminescent immunoassay; serological diagnosis