微血管密度和血管生成擬態在子宮腺肌癥中的表達及意義*

王木森　孫春風　柳雅玲

( 1.東阿縣人民醫院，山東 聊城　252201；　2. 泰山醫學院病理學教研室，山東 泰安　271000)

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微血管密度和血管生成擬態在子宮腺肌癥中的表達及意義*

王木森1孫春風1柳雅玲2

( 1.東阿縣人民醫院，山東 聊城252201；2. 泰山醫學院病理學教研室，山東 泰安271000)

摘要：目的探討微血管密度和血管生成擬態在子宮腺肌癥中的表達及意義。方法選取我院2012年10月至2014年10月間組織病理確診子宮腺肌癥患者 40 例作為觀察組，再選取 40 例非子宮腺肌癥子宮切除患者作為對照組。采用免疫組織化學 S-P 法，用 CD31單克隆抗體對兩組患者進行表達情況的標記分析。采用特殊染色PAS觀察兩組患者血管生成擬態存在情況。結果在觀察組子宮腺肌癥異位內膜、在位內膜和對照組內膜組織中，CD31標記的微血管密度分別為32.850、22.275和14.275.均數間經兩兩比較的q檢驗，任意兩組間比較，均具有統計學意義(P < 0. 001) 。三組經PAS染色，均未觀察到血管生成擬態。結論在子宮腺肌癥中，異位內膜、在位內膜、對照組內膜微血管密度依次降低。血管生成因素與異位內膜侵襲能力有著較為密切的關系，可能是促進子宮腺肌癥異位內膜侵襲的重要因素。

關鍵詞：血管密度; 血管生成擬態; 免疫組化

子宮腺肌病是婦科臨床工作中的常見疾病, 好發于30 ～ 50 歲的育齡期女性，其發病率在不同人群中差異較大，總體發病率為8%～62%[1-2]。子宮腺肌癥有類似惡性腫瘤的浸潤性生長模式，文獻報道其發病與血管生成等因素有關[3]，血管生成擬態(vasculogenic mimicry，VM)可能是毛細血管發生的早期事件[4]。本研究運用免疫組化方法，從蛋白水平觀察微血管密度在異位內膜、在位內膜和對照組中大小，并用特殊染色PAS觀察血管生成擬態。本次研究選取我院 2012年10月至2014年10月間經組織病理確診的子宮腺肌癥和非子宮腺肌癥患者子宮切除標本各40例，分別作為觀察組和對照組，以探討血管生成因素在子宮腺肌癥異位內膜侵襲性生長中的促進作用。現將研究情況報告如下。

1資料與方法

1. 1一般資料選取我院 2012年10月至2014年10月期間接收的全切子宮標本80例，子宮內膜均為增殖期狀態，并且均排除了子宮內膜腫瘤性病變、卵巢惡性腫瘤，亦排除了其它嚴重的全身性疾病。入選病例所有患者年齡為39～55歲，平均年齡46.3歲，觀察組與對照組患者的年齡方面無差異，且患者術前3月均未服用過雌、孕激素類制劑治療。

1. 2方法將經10%中性緩沖福爾馬林固定，常規石蠟包埋的組織制成4μm的連續切片。選擇試劑: 即用型快捷免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒，鼠抗人CD31免疫組化單克隆抗體(克隆號JC/70A)。 嚴格按照染色程序，以說明書具體要求，依照步驟進行實驗。對照設計:每一批切片均設有陽性對照和陰性對照。組織內毛細血管內皮細胞為陽性內對照，用免疫組化片組織內背景作為陰性對照。CD31陽性著色模式為細胞膜染色，呈淺黃色至棕黃色顆粒狀，用于MVD計數。采用Weidner微血管密度計數法[5]:在低倍視野下(4×10)于微血管數量最密集區域(熱點,hot spot)，選取5個高倍鏡視野(20×10),計數每個高倍鏡視野內微血管數(著色的血管內皮細胞或內皮細胞條索即標記為 1條血管), 取其平均值。若管腔中內皮細胞數目>8個或者有平滑肌束的厚壁血管計數時予以排除。糖原PAS染色陽性為沒有血管內皮細胞襯覆的孔道、圖案樣結構顯示深淺不一的紅色或紫紅色。

1. 3統計學方法所有數據結果均經Excel數據庫整理，應用SAS 9.1和PEMS統計軟件包處理。進行F檢驗和秩和檢驗，組間的兩兩比較應用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

CD31所標記的微血管密度在實驗組異位內膜、在位內膜及對照組內膜中的表達(見表1): 均數間經兩兩比較的q檢驗，任意兩組間比較均有統計學意義(P<0.001)。異位增殖期內膜微血管密度高于在位增殖期內膜；在位增殖期內膜高于對照組增殖期內膜；異位增殖期內膜高于對照組內膜。CD31所標記的微血管密度異位內膜>在位內膜>對照組內膜(圖1)。三組均未發現血管生成擬態(圖2)。

表1　MVD在異位內膜、在位內膜及對照組中的平均計數

均數間經兩兩比較的SNK-q檢驗，任意兩組間比較的差異均有統計學意義(P<0.001)。

圖1　CD31在子宮內膜中的表達

圖2　糖原PAS染色在異位內膜中陰性表達

3討論

子宮腺肌病之異位子宮內膜的侵襲性生長離不開血液供應，因此研究人員推測微血管生成是子宮腺肌病的關鍵發病機制之一[5-6]。國內有學者楊堯華等研究顯示，血管生成因素可能在子宮腺肌病發病過程中發揮著不可忽視的作用[7]。某些血管生成因子與抑制因子活性失去平衡，細胞外基質和毛細血管基底膜的酶解，毛細血管內皮細胞增殖分裂、出芽、遷徙，新的原始血管不斷分化成熟，最終形成新生毛細血管。該調節過程有眾多蛋白及細胞因子的參與，包括蛋白水解酶、透明質酸酶、整合素家族、細胞因子和其它粘附分子等，其中血管生成有關因素起著至關重要的作用，包括與血管形成有關的指標CD31、CD34，還有血管內皮生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子(TNF)等，共同發揮調節血管生成的作用[8]。

CD31與新生血管密切相關，是最常用的血管內皮細胞標記物。其細胞質陽性表達敏感性與穩定性均較強，并能更準確的測定微血管密度。本研究結果顯示觀察組異位、在位子宮內膜與對照子宮內膜組織中均可見 CD31陽性表達，陽性細胞呈現細小棕黃色顆粒，且主要表達于子宮內膜間質血管內皮細胞膜或細胞漿內。通過對微血管密度的測定顯示，MVD 于實驗組異位內膜的測定水平顯著高于在位內膜，差異有統計學意義(P<0.001)；且在位內膜 MVD 水平亦顯著高于對照組內膜，差異有統計學意義(P<0.001)。微血管密度的提高提示子宮腺肌病患者異位內膜與在位內膜具有顯著增強的血管生成潛在能力，且子宮內膜異位至肌層后其血管生成能力較在位子宮內膜亦顯著增強，并強于對照組子宮內膜，更進一步顯示子宮腺肌病患者，異位內膜中微血管處于極其過度增生活躍狀態，以利于異位內膜侵襲生長，促使異位病灶進一步增大。分析其與在位內膜及對照組內膜微血管密度，探討其可能的促微血管形成機理，阻斷微血管生成可能是治療子宮腺肌病的有效手段之一，為子宮腺肌病的臨床治療提供客觀理論依據。

血管生成擬態與常見的依賴內皮細胞襯里的毛細血管不同， VM 是一種類似圖案樣、管狀的孔道，內充有循環血液細胞，以滿足高侵襲性的腫瘤細胞對氧的需求。血管生成擬態存在時，惡性腫瘤細胞壞死不明顯，顯示VM存在區域的確有有效的血液供應形式存在。在微環境中，腫瘤迅速增長和血供不足會導致微環境缺氧，能夠引起缺氧誘導因子(hypoxia-in -ducible factor，HIF-1α) 的過度表達，可以上調其下游基因的表達和轉錄，比如血管內皮生長因子A(VEGF-A) 可通過VEGFR - 2激活ERK1/2，從而促進VM的形成[9]; VEGF 還可造成腫瘤組織內血管通透性升高，造成大量血漿蛋白滲出毛細血管外，為血管生成擬態的形成提供了暫時性基質，也為新生毛細血管提供了物質基礎。此外，VEGF 又能上調VE- cadherin 和EphA2的表達水平，從而導致VM 的形成。

采用糖原PAS染色顯示血管生成擬態存在情況，文獻中多有報道[10-12]。糖原PAS染色顯示紫紅色的基底膜是最重要的VM判讀依據之一，但有時 PAS染色陽性基底膜樣物質可能會不連續，若存在紅細胞、血漿等成分亦支持是VM結構。VM的形成通常是惡性腫瘤細胞通過自身變形和基質重塑產生脈管樣通道,通道內無血管內皮細胞襯覆,通道外基底膜糖原PAS染色為陽性。子宮腺肌癥異位內膜浸潤性生長模式類似惡性腫瘤，其是否存在血管生成擬態國內外文獻沒有報道。本實驗AM異位內膜、在位內膜及對照組內膜均未發現VM存在，可能與本組樣本量較少、實驗方法或者選擇指標不恰當有關，也可能AM異位內膜侵襲性依賴毛細血管生成，而沒有VM的形成。

參考文獻：

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[2]姬海寧，辛彥. 血管生成擬態研究進展[J]. 中華腫瘤防治雜志，2013， 18(21) : 1736 -1740.

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[11]劉文斌，許戈良，莢衛東，等. 缺氧對肝癌血管生成擬態的影響及其機制[J]. 世界華人消化雜志，2014，18 (31) : 3294-3300.

[12]張旭,陳宣世,劉俊. 乳腺癌血管生成擬態與MVD、MMP-2表達及預后的關系[J]. 現代醫藥衛生,2013,18(10):2693-2695.

*作者簡介：王木森(1975—)，男，山東東阿人，主治醫師，碩士，主要從事臨床病理學工作。

通訊作者：柳雅玲

中圖分類號：R365

文獻標識碼：A

文章編號：1004-7115(2016)07-0754-03

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.07.008

(收稿日期2016-03-27)：

The expression and significance of microvascular density and angiogenesis mimicry in uterine adenomyosis

WANG Mu-sen1SUN Chun-feng1LIU Ya-ling2

(1.Dong'e People's Hospital, Liaocheng 252201，China; 2.Taishan Medical University, Taian 271000，China)

Abstract:Objective: To investigate the microvascular density and angiogenesis mimicry in the expression and significance of uterine adenomyosis.Methods: Forty patients with histopathologic diagnosis of uterine adenomyosis were selected as observation group in our hospital between 2012and October 10, 2014, then 40 cases of adenomyosis uterine hysterectomy patients were selected as control group.Using immunohistochemical S-P method, CD31monoclonal antibody expression of two groups of patients were analyzed.Special staining PAS was used to observe angiogenesis mimicry in both groups.Results: In the uterine adenomyosis ectopic endometrium and the lining in the endometrium in the observation group, and endometrial tissue in the control group in the organization, CD31markers of microvascular density were 32.850, 22.275and 14.275, respectively. The mean between the two in the q test showed that the comparison between the two groups was statistically significant (P < 0. 001).Angiogenesis mimicry was not observed in the three groups by PAS staining. Conclusion: In the uterine adenomyosis, ectopic endometrium, the lining in ectopic and microvascular density of the control reduced in turn.Angiogenic factors and ectopic endometrial invasive ability have a close relationship, which may be one of the important factors promoting ectopic endometrium invasion of uterine glands.

Key words:microvascular density; angiogenesis mimicry; immunohistochemical