骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合超短波對(duì)大鼠脊髓損傷后早期GFAP和ED?1的影響

孫師，萬(wàn)峪岑，趙利娜，尹艷梅，陸宇，馮智萍，周禹鑫，張志強(qiáng)，張立新

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院康復(fù)科，沈陽(yáng) 110022）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合超短波對(duì)大鼠脊髓損傷后早期GFAP和ED?1的影響

孫師，萬(wàn)峪岑，趙利娜，尹艷梅，陸宇，馮智萍，周禹鑫，張志強(qiáng)，張立新

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院康復(fù)科，沈陽(yáng) 110022）

目的探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）聯(lián)合超短波治療對(duì)大鼠脊髓損傷（SCI）后4周功能恢復(fù)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）和ED?1表達(dá)的影響。方法30只雌性SD大鼠，隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、對(duì)照組、超短波組、BMSCs組、超短波+BMSCs組，采用改良Allen′s法制作大鼠SCI模型，術(shù)后1 d、1周、2周、3周、4周用BBB評(píng)分法評(píng)價(jià)后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。術(shù)后4周取材，行GFAP和ED?1免疫組化染色，測(cè)定其蛋白表達(dá)的積分光密度值，進(jìn)行比較分析。結(jié)果術(shù)后4周超短波組、超短波+ BMSCs組的BBB評(píng)分顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），BMSCs組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。僅超短波+ BMSCs組GFAP的陽(yáng)性表達(dá)顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。超短波組、BMSCs組、超短波+BMSCs組ED?1表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論單純超短波治療即可明顯改善SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)；超短波及BMSCs移植治療均可減輕炎癥，以超短波作用最為顯著，二者聯(lián)合治療在促進(jìn)功能恢復(fù)上并未顯現(xiàn)出協(xié)同作用，但是在減輕炎性反應(yīng)和膠質(zhì)瘢痕形成上有協(xié)同作用。

脊髓損傷；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；超短波；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；ED?1

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脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）因其病理機(jī)制非常復(fù)雜、致殘致死率高，成為醫(yī)學(xué)界的難題和熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，干細(xì)胞科學(xué)的飛速發(fā)展為醫(yī)學(xué)界及廣大SCI患者帶來(lái)了希望［1］。本課題組在前期研究中，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）移植治療與傳統(tǒng)理療方法超短波治療結(jié)合，結(jié)果證實(shí)，在大鼠SCI后7周，BMSCs聯(lián)合超短波治療可減少炎癥的表達(dá)，且BMSCs可分化成星形膠質(zhì)樣細(xì)胞，但對(duì)減少瘢痕的形成無(wú)明顯意義［2］。本文旨在研究SCI后4周，BMSCs聯(lián)合超短波治療對(duì)大鼠SCI后早期功能恢復(fù)及炎癥、瘢痕的影響，探討其對(duì)大鼠SCI后早期和晚期的影響有無(wú)差異及趨勢(shì)變化，并探討其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器設(shè)備

4周齡SD幼鼠3只及8～10周齡SD大鼠35只（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供），胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰酶（美國(guó)Hyclone公司），小鼠抗大鼠ED?l單克隆抗體（美國(guó)Millpore公司），山羊抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），兔抗山羊二抗試劑盒（武漢博士德生物工程公司），SABC試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），DAB顯色劑（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），石蠟切片機(jī)（RM2245，德國(guó)Leica公司），顯微圖像成像系統(tǒng)（DMD108，德國(guó)Leica公司），光學(xué)顯微鏡（BS?60，日本Olympus公司），電子分析天平（德國(guó)Satorius公司），醫(yī)用五官超短波治療儀（上海醫(yī)用設(shè)備廠，頻率為40.68 MHz，最大輸出功率為40 W）。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分離和制備：取4周齡、體質(zhì)量90～110 g的SD幼鼠3只，10%水合氯醛腹腔麻醉（0.33 mL/100 g）后乙醇浸泡。在無(wú)菌條件下取出干骺端完整的股骨，剝離骨表面的肌肉組織，PBS漂洗后剪去骨骺端，暴露骨髓腔。用含10%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)液5 mL沖洗骨髓腔，將沖洗出來(lái)的骨髓懸液進(jìn)行反復(fù)抽吸，以打散細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（密度為8×103/cm2），置于5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液，之后每24 h換液1次，直至細(xì)胞貼壁、近80%～90%融合時(shí)，用胰酶-EDTA混合液在37℃消化2 min，進(jìn)行傳代培養(yǎng)直至第3代。

1.2.2SCI動(dòng)物模型的制備：取8周齡雌性SD大鼠35只，體質(zhì)量180～250 g，10%水合氯醛腹腔麻醉（0.33 mL/100 g）。無(wú)菌條件下打開T9～T11平面椎管，暴露T10節(jié)段脊髓，采用改良Allen′s法制作SCI模型［3］，打擊強(qiáng)度為l0 g重量、10 cm高度自由落體打擊。大鼠立即出現(xiàn)后肢痙攣和一過性鼠尾擺動(dòng)視為造模成功，蘇醒后BBB評(píng)分為0～1分。術(shù)后傷口局部青霉素沖洗防止感染，3 d內(nèi)每天經(jīng)腹腔注射青霉素8萬(wàn)U，術(shù)后每日早晚排尿2次，直至正常的排尿反射建立。術(shù)后仔細(xì)觀察大鼠傷口愈合情況，預(yù)防褥瘡、泌尿系感染等并發(fā)癥。35只大鼠中，蘇醒后評(píng)分過高2只，死亡3只，剔除后共30只。

1.2.3分組及干預(yù)方法：假手術(shù)組6只，模型組24只隨機(jī)分成對(duì)照組、超短波組、BMSCs組、超短波+ BMSCs組，每組保證納入數(shù)據(jù)分析的大鼠各6只。假手術(shù)組僅單純咬除椎板，不做脊髓打擊，無(wú)脊髓損傷。對(duì)照組打擊脊髓造成SCI，不給予任何治療。超短波組于損傷后24 h給予脊髓受損部位小劑量超短波治療，將大鼠固定于特制的塑料固定器內(nèi)，不需麻醉，直徑為4 cm的圓形電極板在脊髓受損部位兩側(cè)對(duì)置，與皮膚的間隙為2 cm，第1檔調(diào)諧后實(shí)際輸出功率約為11.58 W，每日1次，每次7 min，直至取材前1 d）。BMSCs組損傷后1周使用微量注射器將傳至第3代的BMSCs（細(xì)胞密度為1× 106/μL）5 μL垂直注射入損傷區(qū)域中心。超短波+ BMSCs組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予相同方法的小劑量超短波治療及相同數(shù)量的BMSCs移植。

1.2.4取材：SCI后4周，10%水合氯醛腹腔麻醉，仰臥位暴露心臟和肝臟，首先經(jīng)心臟-升主動(dòng)脈灌注4℃預(yù)冷的生理鹽水約200 mL，肝臟顏色變淺，更換4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定液約200 mL，至大鼠四肢震顫、僵硬。取出脊髓，以T10損傷處為中心，向頭尾端切取共長(zhǎng)l cm的組織，置于4%多聚甲醛固定液中4℃固定24 h，石蠟包埋，沿脊髓長(zhǎng)軸縱向連續(xù)切片，片厚3 μm。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1BBB評(píng)分：術(shù)后第1天及1、2、3、4周對(duì)模型組大鼠進(jìn)行BBB行為學(xué)評(píng)分［4］，評(píng)分采用雙人雙盲法，觀察時(shí)間為4 min。0分為全癱，21分為正常大鼠。

1.3.2免疫組化分析：每個(gè)標(biāo)本選取脊髓組織切片共10張，常規(guī)脫蠟，高壓抗原修復(fù)8 min，3%H2O2溶液中孵育20 min，10%胎牛血清封閉20 min，分別滴加小鼠抗大鼠ED?l單克隆抗體（1∶2 000，美國(guó)Mill?pore公司）、山羊抗大鼠GFAP多克隆抗體（1∶400，美國(guó)Santa Cruz公司），陰性對(duì)照用PBS代替一抗，4℃過夜；復(fù)溫2 h后PBS沖洗3次，分別滴加SABC試劑（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、兔抗山羊二抗試劑（武漢博士德生物工程公司），具體步驟按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用顯微圖像成像系統(tǒng)（DMD108，德國(guó)Leica公司）對(duì)每張切片進(jìn)行拍照（400×），每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野。采用Image?Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像處理，測(cè)量積分光密度值（integrated optical density，IOD）并計(jì)算其平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，若有意義，進(jìn)一步采用Bonferroni檢驗(yàn)方法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　　結(jié)果

2.1行為學(xué)評(píng)分

模型組大鼠在SCI后均出現(xiàn)雙下肢癱瘓，術(shù)后1d BBB評(píng)分為0～1分，說(shuō)明SCI動(dòng)物模型造模成功。術(shù)后1～4周，隨時(shí)間延長(zhǎng)各組運(yùn)動(dòng)功能均顯示不同程度恢復(fù)。術(shù)后2～4周，各時(shí)間點(diǎn)超短波組和超短波+BMSCs組BBB評(píng)分均明顯好于對(duì)照組（P＜0.001），而BMSCs組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說(shuō)明SCI術(shù)后4周內(nèi)，改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能的治療中以超短波作用為主，超短波治療和BMSCs移植二者并未顯現(xiàn)出協(xié)同作用（表1）。

表1　　不同時(shí)間點(diǎn)各組BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分Tab.1　BBB scores of all groups at different time points after SCI

2.2免疫組化染色

圖1　各組損傷區(qū)域ED?1免疫組化染色 ×400Fig.1　Immunohistochemical staining of ED?1 around damage area in all groups×400

免疫組化染色后（圖1）顯微鏡下可見，假手術(shù)組只有極少量ED?1陽(yáng)性細(xì)胞，零散分布，而4個(gè)模型組中ED?1表達(dá)明顯增多，在損傷脊髓空洞周圍呈局域性散在分布，細(xì)胞體積較假手術(shù)組增大。假手術(shù)組、對(duì)照組、超短波組、BMSCs組、超短波+BMSCs組IOD值分別為19 110±9 104、120 203±9 471、88 354±10 003、99 064±11 934、67 926±8 384。可見各組ED?1表達(dá)均較假手術(shù)組升高，但超短波組、BMSCs組、超短波+BMSCs組ED?1表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。其中超短波+BMSCs組ED?1下降尤為顯著，與超短波組及BMSCs組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。

SCI后4周，鏡下觀察GFAP陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)（圖2），假手術(shù)組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞在脊髓各處均有表達(dá)，細(xì)胞排列較整齊，胞體較小，其突起較為纖細(xì)、伸向四周；而4個(gè)模型組中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，以空洞周圍尤為顯著，細(xì)胞體積明顯增生、肥大，突起數(shù)目及細(xì)胞間的連接增多，其中超短波+ BMSCs組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)逐漸接近假手術(shù)組。假手術(shù)組、對(duì)照組、超短波組、BMSCs組、超短波+ BMSCs組IOD值分別為30 520±7 412、287 125± 20 772、270 329±37 617、261 855±17 524、241 009± 10 505。可見假手術(shù)組的GFAP陽(yáng)性表達(dá)較少，SCI后表達(dá)明顯增多；SCI后4周，超短波組、BMSCs組、超短波+BMSCs組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均低于對(duì)照組，但只有超短波+BMSCs組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2　SCI術(shù)后4周各組損傷區(qū)域GFAP免疫組化染色 ×400Fig.2　Immunohistochemical staining of GFAP around damage area in all groups×400

3　　討論

BMSCs可以分化為外胚層來(lái)源的神經(jīng)組織細(xì)胞［5］，具有來(lái)源廣泛、取材方便、分離純化容易、具有多向分化潛能、排斥反應(yīng)小、不存在倫理學(xué)爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，因而成為干細(xì)胞移植治療的最適細(xì)胞種子［6］。超短波作為高頻電的一種，廣泛應(yīng)用于臨床，主要用于改善血液循環(huán)、減輕炎癥及水腫。其作用機(jī)制分為熱效應(yīng)及非熱效應(yīng)，小劑量超短波發(fā)揮作用的機(jī)制以非熱效應(yīng)為主，即治療時(shí)無(wú)明顯的溫?zé)岣校梢鹕砉δ芑虿±磉^程的變化［7］。其機(jī)制為高頻電磁場(chǎng)的方向不斷發(fā)生變化，電場(chǎng)兩端電位差電壓也不斷變化，從而產(chǎn)生超高頻的電振蕩波，處于高頻電場(chǎng)中的生物體會(huì)在電振蕩波的作用下發(fā)生細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)共振和液體表面張力的改變，場(chǎng)強(qiáng)變大，細(xì)胞伸展，場(chǎng)強(qiáng)變小，細(xì)胞恢復(fù)原狀。小劑量超短波的治療頻率所產(chǎn)生的低場(chǎng)強(qiáng)電場(chǎng)（40 mW/cm2）可使細(xì)胞充分伸縮，對(duì)細(xì)胞和組織產(chǎn)生特殊刺激，從而引起特殊生物學(xué)作用。研究已經(jīng)證實(shí)，超短波單獨(dú)治療周圍神經(jīng)損傷能夠促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌及神經(jīng)再生［8］，SCI后7周BMSCs與超短波聯(lián)合治療，能促進(jìn)SCI大鼠后肢功能的恢復(fù)并減輕炎癥［2］。

SCI后導(dǎo)致功能障礙的主要病理機(jī)制為SCI后的繼發(fā)性損傷，即原發(fā)的機(jī)械性損傷后發(fā)生的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、自由基等有毒物質(zhì)釋放、血管壁通透性增加致局部組織出血水腫等，導(dǎo)致?lián)p傷部位的微環(huán)境發(fā)生變化，使脊髓的功能進(jìn)一步惡化［9?10］。而小膠質(zhì)細(xì)胞和脊髓中的巨噬細(xì)胞是促炎性因子和氧化應(yīng)激的重要來(lái)源。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，負(fù)責(zé)清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的斑塊、感染性物質(zhì)和損壞的神經(jīng)。SCI后原本靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活［11］，而過多激活或失控的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)通過分泌炎性細(xì)胞因子、神經(jīng)毒素等引起神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡［12］。ED?l是小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及巨噬細(xì)胞聚集后ED?1的表達(dá)增加［13］。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元起支持、保護(hù)、營(yíng)養(yǎng)和參與代謝的作用［14］。SCI后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能活躍及膠質(zhì)化，形成瘢痕組織。活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的膠質(zhì)瘢痕具有兩方面的作用：一方面可分泌大量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子改善局部微環(huán)境，并使損傷組織重新獲得形態(tài)上的穩(wěn)定性；另一方面，膠質(zhì)瘢痕形成了一個(gè)新的屏障，阻斷了斷端間的神經(jīng)聯(lián)系和新生神經(jīng)的延伸［15］，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量軸突生長(zhǎng)抑制因子［16］，阻礙軸突再生，從而影響功能恢復(fù)。因此，明確有益的治療時(shí)機(jī)，控制并減少瘢痕的形成，對(duì)SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)尤為重要。

本研究在大鼠SCI后4周內(nèi)予以超短波和BMSCs移植聯(lián)合治療，并進(jìn)行BBB行為學(xué)評(píng)分。結(jié)果顯示，SCI術(shù)后1～4周隨時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的運(yùn)動(dòng)功能均呈不同程度恢復(fù)。術(shù)后2～4周，超短波組及超短波+BMSCs組BBB評(píng)分恢復(fù)明顯，與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），但超短波組及超短波+BMSCs組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，BMSCs組與對(duì)照組比較，BBB評(píng)分雖有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。說(shuō)明SCI后4周內(nèi)，在改善大鼠行為學(xué)功能上，以超短波的作用為主。這與前期研究中大鼠SCI后7周內(nèi)行為學(xué)改善的變化趨勢(shì)一致，但與已有的一些研究結(jié)論不符，其機(jī)制可能因?yàn)槌滩ň哂懈纳蒲貉h(huán)、增強(qiáng)組織營(yíng)養(yǎng)、減輕炎癥水腫的作用，超短波組及時(shí)且持續(xù)的治療使受損脊髓組織的炎性反應(yīng)得到控制，從而減輕了SCI后的繼發(fā)性損傷，同時(shí)還能挽救損傷部位周圍水腫帶的組織細(xì)胞，避免其缺血缺氧壞死，從而減輕了損傷程度；而BMSCs組行為學(xué)評(píng)分無(wú)明顯改善可能與術(shù)后1周行BMSCs移植時(shí)造成脊髓組織的二次損傷有關(guān)；超短波+BMSCs組因?yàn)槌掷m(xù)的超短波治療，及時(shí)減輕了二次損傷導(dǎo)致的炎癥水腫等不利因素影響，前期研究提示超短波還能促進(jìn)BMSCs存活［2］，而存活的BMSCs具有分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、改善微環(huán)境等作用，故聯(lián)合治療效果尤為明顯。

在炎癥的控制方面，SCI后4周超短波組、BMSCs組、超短波+BMSCs組ED?1表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。其中超短波+BMSCs組ED?1下降最為顯著，與超短波組及BMSCs組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。上述結(jié)果提示，超短波治療和BMSCs移植均可減少小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活化，減輕炎性反應(yīng)，改善損傷組織局部微環(huán)境，而且二者綜合作用效果更強(qiáng)。這與既往研究報(bào)道相符，BMSCs移植后可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向有利于SCI修復(fù)的方向發(fā)展［17］，表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)和功能重塑的作用［18］。而小劑量超短波治療可以增強(qiáng)免疫功能，使吞噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)，同時(shí)血液循環(huán)改善、組織營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)，促使炎癥產(chǎn)物排出，有利于炎癥控制、消散［7］。而與前期研究［2］結(jié)果比較，大鼠SCI后7周，各干預(yù)組ED?1表達(dá)水平的下降與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果與本研究相同，但其結(jié)果中BMSCs組ED?1的減少趨勢(shì)要優(yōu)于超短波組，而本研究中則是超短波組ED?1的下降趨勢(shì)優(yōu)于BMSCs組，提示在控制并減輕炎癥方面，SCI后早期超短波的效果較好，而SCI晚期BMSCs的療效要優(yōu)于超短波。這可能也是本研究中超短波組和超短波+BMSCs組運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)更好的原因之一。

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞主要的骨架蛋白，其表達(dá)的活性高低可反映細(xì)胞的激活和膠質(zhì)化程度。研究結(jié)果顯示，SCI后4周超短波組、BMSCs組及超短波+BMSCs組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)較對(duì)照組均有下降趨勢(shì)，超短波+BMSCs組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示超短波和BMSCs聯(lián)合治療有協(xié)同作用，可減少瘢痕的形成。其機(jī)制可能為BMSCs具有多分化潛能，植入的BMSCs可分化為星形膠質(zhì)樣細(xì)胞［2］，在其轉(zhuǎn)化為增殖狀態(tài)前可改善局部微環(huán)境及分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，故移植BMSCs后瘢痕組織有所減輕。而超短波+BMSCs組效果顯著，提示超短波亦可改善損傷組織局部微環(huán)境。前期研究結(jié)果中［2］，大鼠SCI后7周，超短波+BMSCs組GFAPmRNA表達(dá)雖較其他組減少，但各組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示超短波與BMSCs聯(lián)合治療在控制瘢痕形成上早期的療效要優(yōu)于晚期。這可能因?yàn)樵缙贐MSCs分化的星形膠質(zhì)樣細(xì)胞尚未轉(zhuǎn)化為增殖狀態(tài)，可分泌較多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、改善微環(huán)境的作用較強(qiáng)，而晚期BMSCs分化的星形膠質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化為增殖狀態(tài)，形成膠質(zhì)瘢痕，作用以填充損傷部位、重獲組織的穩(wěn)定性為主。后續(xù)研究中，我們將深入探討其原理。

綜上所述，BMSCs移植和小劑量超短波對(duì)SCI后的治療均有一定效果，二者聯(lián)合治療具有協(xié)同作用，可通過減少瘢痕形成、抑制炎性細(xì)胞因子、減輕炎癥來(lái)促進(jìn)功能的恢復(fù)，這對(duì)SCI的臨床治療具有指導(dǎo)意義。同時(shí)，二者在不同時(shí)間點(diǎn)的作用優(yōu)勢(shì)也不同，未來(lái)我們還將繼續(xù)進(jìn)行超早期的研究，探討上述因子在SCI后各時(shí)期的變化趨勢(shì)及超短波和BMSCs發(fā)揮作用的確切機(jī)制。

［1］GARBOSSA D，F(xiàn)ONTANELLA M，F(xiàn)RONDA C，et al.New strate?gies for repairing the injured spinal cord：the role of stem cells［J］. Neurol Res，2006，28（5）：500-504.DOI：10.1179/016164106X11 5152.

［2］YIN YM，LU Y，ZHANG LX，et al.Bone marrow stromal cells trans?plantation combined with ultrashortwave therapy promotes function?al recovery on spinal cord injury in rats［J］.Synapse，2015，69（3）：139-147.DOI：10.1002/syn.21802.

［3］ALLEN AR.Surgery of experimental lesion of spinal cord equiva?lent to crush injury of fracture dislocation of spinal column：a pre?liminary report［J］.JAMA，1911，57（11）：878-880.DOI：10.1001/ jama.1911.04260090100008.

［4］BASSO DM，BEATTIE MS，BRESNAHAN JC.A sensitive and reli?able locomotor rating scale for open field testing in rats［J］.J Neu?rotrauma，1995，12（1）：1-21.DOI：10.1089/neu.1995.12.1.

［5］PHINNEY DG，ISAKOVA I.Plasticity and therapeutic potential of mesenchymal stem cells in the nervous system［J］.Curr Pharm Des，2005，11（10）：1255-1265.DOI：10.2174/1381612053507495.

［6］PARR AM，TATOR CH，KEATING A.Bone marrow?derived mesen?chymal stromal cells for the repair of central nervous system injury ［J］.Bone Marrow Transplant，2007，40（7）：609-619.DOI：10.1038/sj.bmt.1705757.

［7］梁維娣，張志強(qiáng).超短波和旋磁對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷的影響［J］.中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2006，28（4）：225-228.

［8］ZHANG LX，TONG XJ，SUN XH，et al.Experimental study of low dose ultrashortwave promoting nerve regeneration after acellular nerve allografts repairing the sciatic nerve gap of rats［J］.Cell Mol Neurobiol，2008，28（4）：501-509.DOI：10.1007/s10571?007?9226? 1.

［9］EL MASRI WS，KUMAR N.Traumatic spinal?cord injury［J］.Lan?cet，2011，377（9770）：972-974.DOI：10.1016/S0140?6736（11）60248?1.

［10］DAVID S，BOUCHARD C，TSATAS O，et al.Macrophages can modify the nonpermissive nature of the adult mammalian central nervous system［J］.Neuron，1990，5（4）：463-469.DOI：10.1016/ 0896?6273（90）90085?T.

［11］SCHWARTZ M，YOLES E.Immune?based therapy for spinal cord repair：autologous macrophages and beyond［J］.J Neurotrauma，2006，23（3/4）：360-370.DOI：10.1089/neu.2006.23.360.

［12］POPOVICH PG，GUAN Z，MCGAUGHY V.The neuropathological and behavioral consequences of intraspinal microglial/macrophage activation［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2002，61（7）：623-633. DOI：10.1093/jnen/61.7.623.

［13］YU Q，LIU L，DUAN Y，et al.Wnt/β?catenin signaling regulates neuronal differentiation of mesenchymal stem cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，439（2）：297-302.DOI：10.1016/j. bbrc.

［14］BIGINI P，BASTONE A，MENNINI T.Glutamate transporters in the spinal cord of the wobbler mouse［J］.Neuorreport，2001，12 （9）：1815-1820.DOI：10.1097/00001756?200107030?00011.

［15］SHEARER MC，F(xiàn)AWCETT JW.The astrocyte/meningeal cell in?terface?a barrier to successful nerve regeneration？［J］.Cell Tissue Res，2001，305（2）：267-273.DOI：10.1007/s004410100384.

［16］MCKEON RJ，H?KE A，SILVER J.Injury?induced proteoglycans inhibit the potential for laminin?mediated axon growth on astrocyt?ic scars［J］.Exp Neurol，1995，136（1）：32-43.DOI：10.1006/ exnr.1995.1081.

［17］ABRAMS MB，DOMINGUEZ C，PERNOLD K.Multipotent mesen?chymal stromal cells attenuate chronic inflammation and injury?induced sensitivity to mechanical stimuli in experimental spinal cord injury［J］.Restor Neurol Neurosci，2009，27（4）：307-321. DOI：10.3233/RNN?2009?0480.

［18］MARTINEZ FO，HELMING L，GORDON S.Alternative activation of macrophages：an immunologic functional perspective［J］.Annu Rev Immunol，2009，27：451-483.DOI：10.1146/annurev.immu?nol.021908.132532.

（編輯陳姜）

Effects of Bone Marrow Stromal Cells Transplantation Combined with Ultrashort Wave Therapy on the Expression of GFAP and ED?1 after Spinal Cord Injury in Rats

SUN Shi，WAN Yucen，ZHAO Lina，YIN Yanmei，LU Yu，F(xiàn)ENG Zhiping，ZHOU Yuxin，ZHANG Zhiqiang，ZHANG Lixin
（Department of Rehabilitation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110022，China）

ObjectiveTo investigate the effects of bone marrow stromal cells（BMSCs）transplantation combined with low dose ultrashort wave （USW）radiation on functional recovery and the expression of glial fibrillary acidic protein（GFAP）and ED?1 after spinal cord injury（SCI）in rats，and further discuss its action mechanism.MethodsFemale Sprague?Dawley rats（n=30）were randomly divided into 5 groups：sham?oper?ated，as well as control，USW，BMSCs，and USW+BMSCs that were subjected to spinal cord injury（SCI）.Basso?Beattie?Bresnahan（BBB）tests were carried out before the operation and at 1 d，1 week，2 weeks，3 weeks，4 weeks after SCI.4 weeks later，animals were sacrificed and tissues were collected to make paraffin section.Immunohistochemical staining was performed to observe the expression of GFAP and ED?1.Results4 weeks after SCI，BBB scores were significantly higher in the USW and USW+BMSCs groups than in the control group（bothP＜0.001）.No signifi?cant difference was observed between the BMSCs group and control group.On the expression of GFAP，only USW+BMSCs group showed signifi?cantly decreased compared with the control group（P＜0.05）.All treatment groups exhibited lower ED?1 expression than the control group（all P＜0.05）.ConclusionOur results indicate that USW radiation alone can obviously improve neural functional recovery after SCI.The USW radi?ation and BMSCs transplantation treatment can reduce inflammation，and USW radiation is more effective.The combination therapy did not show a synergistic action on promoting functional recovery，but do have an effect on reducing the inflammatory response and glial scar formation.

spinal cord injury；bone marrow stromal cells；ultrashort；glial fibrillary acidic protein；ED?1

R651.2

A

0258-4646（2016）08-0678-06

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.002

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（81101462）

孫師（1986-），女，醫(yī)師，本科.

張立新，E-mail：zhanglx@sj?hospital.org

2015-12-21
網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：