補體C3f去精氨酸片段對系統性硬化癥小鼠皮膚纖維化模型構建及轉化生長因子β1表達的影響

陳安平　向文雯　夏　燕　馮　佳　楊年安　袁　林　徐　建　向　陽

(湖北民族學院風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北　恩施　445000)

?

補體C3f去精氨酸片段對系統性硬化癥小鼠皮膚纖維化模型構建及轉化生長因子β1表達的影響

陳安平向文雯1夏燕馮佳楊年安袁林徐建2向陽

(湖北民族學院風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北恩施445000)

〔摘要〕目的探討補體C3f去精氨酸片段(DRC3f)對于系統性硬化癥(SSc)小鼠皮膚纖維化模型構建和轉化生長因子(TGF)-β1表達的影響。方法采用DRC3f聯合博來霉素皮下注射的方法構建SSc小鼠模型，并用纖維染色和免疫組化方法比較聯合與不聯合DRC3f對SSc小鼠皮膚纖維化、皮膚增厚程度和TGF-β1表達的影響。結果聯合DRC3f和博來霉素注射組與單用博來霉素和博來霉素聯合無關多肽組比較，皮膚纖維化程度更加明顯，TGF-β1的表達也明顯增多(P<0.05)。結論DRC3f能夠促進SSc模型小鼠皮膚纖維化和炎癥因子TGF-β1的表達。

〔關鍵詞〕補體C3f去精氨酸片段；系統性硬化癥；皮膚纖維化；轉化生長因子-β1

系統性硬化癥(SSc)的血管損害機制迄今未明，補體C3片段(C3f)和去精氨酸C3f(DRC3f)是補體活化過程中C3b失活產生的多肽片段，前期研究顯示，它們在誘導SSc的血管內皮細胞增殖中起重要作用。本研究進一步運用DRC3f聯合博來霉素(Blm)注射，觀察其對模型小鼠皮膚纖維化和轉化生長因子(TGF)-β1表達的影響。

1材料與方法

1.1動物來源及試劑BALB/c小鼠購自武漢大學實驗動物中心，清潔級，雌性6周齡，體重17～20 g。飼養于湖北民族學院實驗動物部清潔級動物實驗室。鹽酸Blm購自日本化藥株式會社(批號：820232)。二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。兔抗鼠TGF-β1(sc7784)多克隆抗體購自Santa Cruz公司。超敏二步法免疫組化檢測試劑PV-9001購自中杉金橋生物制品科技有限責任公司。

1.2方法

1.2.1Blm皮下注射鹽酸Blm以0.01 mmol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解成200 μg/ml。將BALB/c小鼠隨機分為四組，每組10只，均剃去背部中央區被毛。A組以4.5號無菌注射針在該部位皮下注射100 μl PBS，B組注射200 μg/ml Blm 100 μl、C組注射Blm+DRC3f各100 μl(Blm為200 μg/ml、DRC3f為5 μg/ml)、D組注射Blm+無關多肽纖維蛋白肽A(FPA)各100 μl(Blm為200 μg/ml、FPA為5 μg/ml)。

1.2.2蘇木素-伊紅(HE)染色和纖維染色按操作常規制備皮膚組織切片和肺組織切片，行HE 染色，觀察皮膚和肺組織學改變，應用醫學彩色病理圖像分析系統測定真皮厚度，每張切片隨機取5 處測皮膚厚度，求得其均值。觀察各組小鼠皮膚厚度的差異。各組小鼠皮膚組織切片加作纖維染色。染色結果：膠原纖維呈亮綠色，肌纖維呈紅色，細胞核呈藍褐色。

1.2.3免疫組織化學染色檢測各組小鼠皮膚組織中靶向沉默誘騙受體3(DcR3)的表達(1)小鼠皮膚標本常規石蠟切片，厚為4 μm，脫蠟至水；(2)37℃過夜烤干；(3)2%H2O2去過氧化物酶5 min，PBS洗3次，5 min/次；(4)5%胎牛血清(BSA)封閉1 h；(5)加入一抗4℃過夜；(6)取出平衡至室溫1 h；(7)Tris鹽酸緩沖液(TBS)洗3次，每次5 min；(8)加入稀釋好的二抗(1∶500)37℃ 30 min；(9)TBS洗3次，每次5 min；(10)3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)染色終止復染；(11)同時設立陰性對照，以PBS代替一抗，其余步驟不變。

1.2.4染色結果判定標準用細胞免疫組織化學定量分析系統測定化學染色皮膚組織切片圖像(×10)，每張切片隨機取3 個視野，每個視野大小為8 500 μm2，以亮綠色(膠原纖維)為陽性，計算每一視野中陽性表達強度，并測定其表達的陽性面積，然后計算平均值。再計算每份標本的膠原纖維組織化學指數。在免疫組織化學染色的皮膚組織，凡胞質或基質中出現明顯的棕黃色至黃粉色顆粒者為陽性。用細胞免疫組織化學定量分析系統(Version 2.0)采集免疫組織化學染色皮膚組織切片圖像，每張切片隨機取3 個視野，每個視野為8 500 μm2，以棕黃色為陽性，計算每一視野中TGF-β1免疫組織化學陽性表達強度，并測定其表達的陽性面積，然后計算平均值。計算每只小鼠的免疫組織化學指數。

1.3統計學方法應用SPSS10.0軟件行χ2檢驗。

2結果

2.1皮膚組織病理學改變B、C、D組小鼠皮膚組織學均顯示真皮層明顯增厚，膠原纖維明顯增生，均質化。 其中C組更加明顯地顯示真皮小血管周圍炎癥細胞浸潤，血管壁明顯增厚，管腔變小或閉塞；皮膚附屬器明顯減少。而A組小鼠皮膚未出現上述改變。B、C、D組小鼠注射2 w后除出現局部皮膚增厚外，尚出現淺潰瘍、毛發脫落，且逐日加重。

2.2各組小鼠皮膚厚度及纖維染色指數的比較見表1，圖1、圖2。

表1　各組小鼠皮膚厚度和纖維染色指數比較±s,n=10)

與A組比較：1)P<0.01；與B組、D組比較：2)P<0.05

2.3肺組織病理學改變B、C、D組小鼠肺組織出現肺泡間隔增厚伴大量單核細胞浸潤，間隙內有少量成纖維細胞增生，小血管壁增厚。A組小鼠未出現上述改變，見圖3。

2.4各組小鼠皮膚組織TGF-β1免疫組織化學指數比較B、C、D組小鼠皮膚組織TGF-β1表達(135 786±27 942、184 923±31 676、137 293±24 791)與A組(37 582±774)比較均明顯增加(P<0.01)；C組與B組和D組比較,其TGF-β1表達更加明顯(P<0.05)。見圖4。

圖1　各組小鼠皮膚纖維染色圖片(×200)

圖2　各組小鼠皮膚HE染色圖片(×40)

圖3　各組小鼠肺部組織HE染色(×40)

圖4　各組小鼠皮膚TGF-β1免疫組化圖片(×40)

3討論

大量研究結果證實SSc的血管病變是造成SSc預后較差的主要原因〔1～4〕。血管內皮細胞增生及基質在血管壁的沉積導致進行性血管腔狹窄并最終閉合〔5〕。因而內皮細胞增殖在SSc并發的血管損害的病理過程中發揮著至關重要的作用。但迄今為止，對于SSc血管內皮細胞過度增殖的發生機制尚不明確。有研究認為，SSc患者體內產生的抗巨細胞病毒抗體與血管內皮細胞中存在交叉免疫反應，繼而引起內皮細胞損傷，導致內皮細胞過度修復反應〔6〕。但抗巨細胞病毒抗體同樣存在于正常人群中，而這一現象在正常人中并未被觀察到〔6〕。SSc作為一種自身免疫性疾病，存在多種針對自身抗原的抗體如抗核抗體、抗著絲點抗體、抗Scl70抗體等。許多研究者在SSc患者體內檢測出抗血管內皮細胞抗體(AECA)，體內及體外實驗也證實，AECA可以介導血管內皮細胞凋亡〔7〕。臨床相關性分析顯示，AECA僅與雷諾現象存在相關性，與肺動脈高壓、肢端壞死性血管病變均無相關性〔8〕。在類風濕關節炎、干燥綜合征等其他風濕性疾病也發現有高滴度AECA，但并未發生SSc樣的血管病變〔7〕。對SSc患者體內其他自身抗體如抗著絲點抗體、抗拓撲酶I抗體等與SSc血管病變的相關性分析也未能得出確定的結果。

對于C3f多肽片段和DRC3f是否具有生物學活性這個問題，目前研究甚少。既往的研究證明，補體系統參與了SSc的病理過程〔9〕。在SSc患者血清中，補體含量增高，補體C3裂解片段C3d在SSc患者血清中也增高，并且C3d∶C3比率增高與SSc病情嚴重程度呈正相關〔10〕。但對于C3f和DRC3f多肽片段在SSc病變過程中的作用一直未見報道。本課題組發現，DRC3f在SSc患者血清中顯著增高，并且DRC3f水平與疾病嚴重程度、病情活動、自身抗體滴度及免疫球蛋白IgG、IgA等增高相關聯〔11〕。筆者在體外用富含高水平DRC3f的SSc患者血清刺激血管內皮細胞，發現富含DRC3f的血清能促進血管內皮細胞的增殖；進一步采用人工合成的C3f和DRC3f刺激培養的血管內皮細胞和成纖維細胞，證實DRC3f能夠促進血管內皮細胞增殖，但對成纖維細胞無作用〔11〕。這些結果表明：C3f和DRC3f在SSc發生血管內皮細胞增殖過程中起關鍵性作用。

目前用Blm建立局部硬皮病模型比較普遍，其可能機制主要是促使組織中T 淋巴細胞增多，尤其是CD8 細胞增多為主，其次是使得活性氧自由基釋放增多從而導致DNA 解鏈或斷鏈，增加磷脂酶A2 的活性，促進炎癥反應，刺激成纖維細胞的增殖、膠原增加，引起纖維化〔14〕。但Blm誘導的SSc 鼠無血管變化或自身抗體，皮膚纖維化程度低且持續時間短。本研究表明，聯合注射DRC3f的小鼠局部DRC3f增多，可以明顯促進皮膚的纖維化程度，促進血管病變，并上調TGF-β1的表達。

4參考文獻

1Pattanaik D，Brown M，Postlethwaite AE.Vascular involvement in systemic sclerosis(scleroderma)〔J〕.J Inflam Res，2011;4(1)：105-25.

2Jacobsen S，Halberg P，Ullman S.Mortality and causes of death of 344 Danish patients with systemic sclerosis(scleroderma)〔J〕.Br J Rheumatol，1998;37(7)：750-5.

3Steen VD，Medsger TA.Changes in causes of death in systemic sclerosis，1972-2002〔J〕.Ann Rheum Dis，2007;66(7)：940-4.

4Belch JJ，McSwiggan S，Lau C.Macrovascular disease in systemic sclerosis：the tip of an iceberg〔J〕?Rheumatology(Oxford)，2008;47(10)：v16-7.

5Kahaleh MB，LeRoy EC.Autoimmunity and vascular involvement in systemic sclerosis(SSc)〔J〕.Autoimmunity，1999;31(3)：195-214.

6Arnson Y，Amital H，Guiducci S，etal.The role of infections in the immunopathogensis of systemic sclerosis--evidence from serological studies〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2009;1173(1)：627-32.

7Hebbar M，Lassalle P，Delneste Y，etal.Assessment of anti-endothelial cell antibodies in systemic sclerosis and Sjogren′s syndrome〔J〕.Ann Rheum Dis，1997;56(4)：230-4.

8Wusirika R，Ferri C，Marin M，etal.The assessment of anti-endothelial cell antibodies in scleroderma-associated pulmonary fibrosis.A study of indirect immunofluorescent and western blot analysis in 49 patients with scleroderma〔J〕.Am J Clin Pathol，2003;120(4)：596-606.

9Benbassat C，Schlesinger M，Luderschmidt C，etal.The complement system and systemic sclerosis〔J〕.Immunol Res，1993;12(3)：312-6.

10Xiang Y，Kurokawa MS，Kanke M，etal.Peptidomics：identification of pathogenic and marker peptides〔J〕.Methods Mol Biol,2010;615(15)：259-71.

11Xiang Y，Matsui T，Matsuo K，etal.Comprehensive investigation of disease-specific short peptides in sera from patients with systemic sclerosis：complement C3f-des-arginine，detected predominantly in systemic sclerosis sera，enhances proliferation of vascular endothelial cells〔J〕.Arthritis Rheum，2007;56(6)：2018-30.

14Yoshizaki A，Yanaba K，Ogawa A，etal.Immunization with DNA topoisomerase-I and Freund′s complete adjuvant induces skin and lung fibrosis and autoimmunity via interleukin-6 signaling〔J〕.Arthritis Rheum，2011;63(11)：3575-85.

〔2015-12-03修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項目：國家自然科學基金項目(81260458)；湖北省自然科學基金項目(2012FFA061)

通訊作者：向陽(1961-)，男，碩士生導師，教授，主要從事風濕免疫性疾病的發病機制研究。

〔中圖分類號〕R392.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3092-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.002

Effection of DRC3f on the dermatofibrosis and TGF-β1 expression of systemic sclerosis mice

CHEN An-Ping,XIANG Wen-Wen,XIA Yan,et al.

Institute of Rheumatology and Immunology, Affiliated Hospital of Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, Hubei, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effection of DRC3f in the dermatofibrosis and TGF-β1 expression of systemic sclerosis mice.MethodsThe systemic sclerosis mice model was made by hypodermic of DRC3f combined with Bleomycin.The expression of TGF-β1 and the level of dermatofibrosis were detected by immunohistochemistry and fibro-stain respectively.ResultsThe level of dermatofibrosis and the expression of TGF-β1 were much higher in the group which was injected of DRC3f combined with Bleomycin.ConclusionsThe DRC3f might probably promote the dermatofibrosis and the expression of TGF-β1 of systemic sclerosis mice.

【Key words】DRC3f; Systemic sclerosis mice; Dermatofibrosis; TGF-β1

1湖北民族學院附屬民大醫院病理科2湖北民族學院科技學院

第一作者：陳安平(1981-),女,碩士,主治醫師,主要從事風濕免疫性疾病的發病機制研究。