草蓯蓉多糖對過氧化氫損傷HepG2細胞NF-κB表達的影響

尹學哲　王玉嬌　尹基峰　全吉淑

(延邊大學附屬醫院，吉林　延吉　133000)

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草蓯蓉多糖對過氧化氫損傷HepG2細胞NF-κB表達的影響

尹學哲王玉嬌1尹基峰全吉淑1

(延邊大學附屬醫院，吉林延吉133000)

〔摘要〕目的探討草蓯蓉多糖(BRPS)對過氧化氫(H2O2)損傷的HepG2細胞核轉錄因子(NF)-κB表達的影響。方法以HepG2細胞為研究對象，通過H2O2誘導細胞氧化應激損傷模型，采用蛋白印跡法檢測NF-κB、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、血紅素氧合酶(HO)-1、環氧化酶(COX)-2以及核因子-E2相關因子2(Nrf2)的蛋白表達。結果H2O2損傷HepG2細胞后，NF-κB p65和Nrf2蛋白水平升高，iNOS、HO-1、COX-2蛋白水平升高。BRPS處理可降低HepG2細胞NF-κB p65水平，對Nrf2蛋白水平無顯著影響。BRPS同時降低iNOS、HO-1蛋白水平，但對COX-2蛋白水平無影響。結論BRPS降低H2O2損傷的HepG2細胞iNOS、HO-1蛋白水平，這可能與降低NF-κB活化有關。

〔關鍵詞〕草蓯蓉多糖；過氧化氫；氧化損傷；HepG2；核轉錄因子-κB

核轉錄因子(NF)-κB參與炎癥、免疫、細胞增殖和凋亡等病理生理過程的基因調控〔1〕，其與肝細胞損傷的關系一直是肝臟疾病研究中的熱點〔2〕。研究證實，急性肝損傷時伴隨著NF-κB的活化，通過NF-κB通路激活肝臟Kupffer細胞，從而造成腫瘤壞死因子(TNF)-α和Fas等基因表達上調，導致肝細胞炎癥，誘發肝細胞凋亡，造成肝功能損害〔2〕。草蓯蓉又名不老草，具有補腎壯陽、滋補強身、潤腸止血、延年益壽的功效，具有抗脂質過氧化、增強免疫、抗炎及抗腫瘤等作用〔3～5〕。草蓯蓉多糖(BRPS)是草蓯蓉重要活性成分，前期研究發現其對過氧化氫(H2O2)所致HepG2細胞氧化應激具有抑制作用，減輕其細胞損傷〔6〕。本實驗擬探索BRPS對損傷HepG2細胞NF-κB及下游炎性蛋白表達的影響。

1材料與方法

1.1藥物與試劑BRPS：醇沉法提取，含量70%〔6〕。人HepG2細胞：南京凱基生物有限公司；DMEM培養基及小牛血清：Gibco公司；兔NF-κB多克隆抗體、兔誘導型一氧化氮合酶(iNOS)多克隆抗體、小鼠血紅素氧合酶(HO)-1單克隆抗體、兔環氧化酶(COX)-2多克隆抗體、兔核因子-E2相關因子2(Nrf2)多克隆抗體：美國Abcam公司。

1.2主要儀器3-30K型離心機,Sigma公司；DYY-12型電泳儀、DYCP-31D型電泳槽、DYCZ-24DN型電泳儀，北京六一儀器廠；Trans-Blot轉印槽，美國Bio-Rad公司；UVP凝膠成像分析儀，美國UVP公司。

1.3細胞培養及分組〔5,6〕HepG2細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下靜置培養，細胞鋪滿瓶底80%以上，取對數生長期增殖活躍的細胞進行分組。對照組換入正常培養液；加入H2O2，使其濃度為300 μmol/L；BRPS組中加入BRPS使其濃度達到50 mg/L，2 h后再加入300 μmol/L H2O2誘導損傷12 h〔5,6〕。

1.4蛋白印跡法檢測NF-κB以及相關炎性蛋白的表達收集并裂解細胞，提取總蛋白，以20 μg蛋白為上樣量，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉移至聚偏乙烯(PVDF)膜上。封閉后，一抗孵育過夜，然后用相應二抗耦聯物反應1 h，增強化學光法(ECL)顯跡，在凝膠成像分析儀中采集圖像并進行灰度分析。

2結果

2.1BRPS對氧化損傷HepG2細胞NF-κB和IκB蛋白表達的影響與對照組比較，H2O2組HepG2細胞NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05)；與H2O2組比較，BRPS組HepG2細胞NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白水平降低(P<0.05)。見圖1。

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下圖同圖1　BRPS對氧化損傷HepG2細胞NF-κB和IκB蛋白表達的影響

2.2BRPS對氧化損傷HepG2細胞iNOS、COX-2、HO-1蛋白表達的影響與對照組比較，H2O2組HepG2細胞iNOS、HO-1、COX-2蛋白水平升高(P<0.05)；與H2O2組比較，BRPS組iNOS、HO-1蛋白水平降低(P<0.05)，COX-2蛋白水平無顯著變化(P>0.05)。見圖2。

圖2　BRPS對氧化損傷HepG2細胞iNOS、COX-2、HO-1蛋白表達的影響

2.3BRPS對氧化損傷HepG2細胞Nrf2蛋白表達的影響與對照組比較，模型組細胞核Nrf2蛋白含量增高(P<0.05)；BRPS處理對細胞核Nrf2蛋白含量有增高趨勢，但無顯著差異(P>0.05)。見圖3。

圖3　BRPS對氧化損傷HepG2細胞Nrf2蛋白表達的影響

3討論

H2O2是一種非常活躍的強氧化劑，能引發一系列的氧化反應進而影響甚至破壞細胞的正常新陳代謝，產生氧化應激，造成細胞損傷；同時產生一系列自由基，激活細胞內轉錄因子NF-κB，從而介導細胞炎癥和凋亡，加重細胞損傷〔7〕。NF-κB是一種具有多向轉錄調節作用的蛋白因子，活性氧可以直接激活NF-κB；活化的NF-κB即可進入細胞核，誘導靶基因的轉錄，促進各種炎癥介質釋放而導致細胞損傷〔8〕。因此，NF-κB途徑被認為是炎癥信號傳導的關鍵〔8〕。本研究發現，H2O2刺激可引起肝細胞NF-κB蛋白活化，使其核轉移增強，導致其下游相關炎性因子iNOS、HO-1、COX-2蛋白表達上調。說明NF-κB激活可使肝細胞炎癥相關靶基因表達上調，導致肝細胞炎癥，造成肝功能損害。而BRPS處理可降低肝細胞NF-κB活化，核轉移減少，下調iNOS和HO-1蛋白表達，從而降低細胞炎癥和損傷。在本研究中，BRPS對肝細胞COX-2蛋白表達無顯著影響，是否還存在其他因素影響COX-2表達還有待研究。此外，HO-1的表達受多種信號途徑的共同調控〔9〕。Nrf2是細胞氧化應激反應中的關鍵因子，對HO-1具有重要的調節作用〔9〕。本研究發現，H2O2損傷HepG2細胞核Nrf2蛋白水平升高，但BRPS對核Nrf2蛋白水平無顯著影響。提示，BRPS下調HO-1蛋白表達可能是由NF-κB介導的，與Nrf2無關。

綜上所述，BRPS能夠抑制肝細胞NF-κB活化和核轉移，使其介導的炎癥相關的靶基因表達下調，這有助于其降低細胞炎癥和細胞損傷。

4參考文獻

1趙外歐，李相軍.NF-κB參與銀杏葉提取物保護血管內皮細胞的作用〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(1):178-9.

2陶立德，薛同敏，張杰，等.缺血預處理對大鼠缺血再灌注肝組織NF-κB表達、炎癥及氧化應激反應的影響〔J〕.中國普通外科雜志，2015；24(1):70-4.

3汪霞，周微，李天，等.草蓯蓉環烯醚萜對肝癌前病變大鼠血清標志酶及抗氧化活性的影響〔J〕.食品科技，2010,35(7):242-5.

4Quan JS,Jin MH,Xu HX,etal.BRP,a polysaccharide fraction isolated from Boschniakia rossica,protects against galactosamine and lipopolysaccharide induced hepatic failure in mice〔J〕.J Clin Biochem Nutr,2014；54(3):181-189.

5尹學哲，王玉嬌，尹基峰，等.草蓯蓉提取物對HepG2細胞氧化應激損傷的保護作用〔J〕.食品科學，2015,36(15):173-8.

6王玉嬌.草蓯蓉多糖對肝細胞氧化損傷的保護作用〔D〕.延吉；延邊大學，2014.

7張祎，陳文，孟憲麗.三黃瀉心湯對全腦缺血再灌注大鼠氧化應激及炎性損傷的保護作用〔J〕.中藥藥理與臨床，2014；30(4):1-5.

8龍石銀，崔慧輝，張彩平，等.二苯乙烯苷對H2O2誘導人臍靜脈內皮細胞核因子κB、腫瘤壞死因子α表達的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志，2010；28(7):510-3.

9劉丹，李冰，董丹丹，等.無機砷對肝細胞轉錄因子Nrf2及其調控蛋白表達影響〔J〕.中國公共衛生，2012；28(9):1188.

〔2015-12-17修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81160539；81360651)

通訊作者：全吉淑(1968-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事中藥藥理學研究。

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3108-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.007

Effect of Boschniakia Rossica polysaccharides on expression of NF-κB in H2O2-damaged HepG2 cells

YIN Xue-Zhe,WANG Yu-Jiao,YIN Ji-Feng,et al.

Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, Jilin, China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of polysaccharides from Boschniakia rossica(BRPS)on expressiion of nuclear factor(NF)-κB in H2O2-damaged HepG2 cells.MethodsThe protein expressions of NF-κB, inducible nitric oxide synthase(iNOS), heme oxygenase(HO)-1, cyclooxygenase(COX)-2 and nuclear factor erythroid2-related factor 2(Nrf2)were determined by Western blot. ResultsDuring the oxidative damage, nuclear levels of NF-κB p65 and Nrf2 proteins were increased, and the protein expressions of iNOS, HO-1 and COX-2 were up-regulated. The administration of BRPS reduced the nuclear NF-κB p65 level while there was no significant change of Nrf2 protein. BRPS also down-regulated the protein expressions of iNOS and HO-1, but had no significant effect on COX-2. ConclusionsBRPS could reduce the levels of iNOS and HO-1 proteins, probably via the reduction of NF-κB activation.

【Key words】Boschniakia rossica; H2O2; Oxidative damage; HepG2; NF-κB

1延邊大學醫學院

第一作者：尹學哲(1962-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事中藥藥理學研究。