阿托伐他汀對膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護作用及對細胞炎性蛋白-2和Toll樣受體-4表達的影響

張世應　凃　靜

(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院藥劑科，湖北　武漢　430000)

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阿托伐他汀對膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護作用及對細胞炎性蛋白-2和Toll樣受體-4表達的影響

張世應凃靜1

(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院藥劑科，湖北武漢430000)

〔摘要〕目的探討阿托伐他汀對膿毒癥大鼠急性肺損傷(ALI)的保護作用及其相關機制。方法采用盲腸結扎穿孔(CLP)方法構建大鼠膿毒癥ALI模型，40只大鼠隨機分為假手術組(S組)、模型組(M組)、阿托伐他汀低劑量組(L組，20 mg/kg)和阿托伐他汀高劑量組(H組，40 mg/kg)，阿托伐他汀治療組術后6 h和18 h腹腔注射不同劑量的阿托伐他汀，S、M組同時間給予等量的生理鹽水腹腔注射。術后20 h處死大鼠收集血液及肺組織標本。測定實驗各組動脈血氣指標、肺水含量、支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量及細胞計數；酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清中細胞炎性蛋白(MIP)-2及Toll樣受體(TLR)-4水平；反轉錄PCR方法檢測肺組織MIP-2及TLR-4 mRNA的表達。結果與M組比較，動脈血氣指標、肺水含量、支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量及細胞計數在L組、H組均顯著改善(P<0.05)，且H組改善更明顯(P<0.05)。與M比較，阿托伐他汀干預組血清MIP-2及TLR-4水平和肺組織MIP-2及TLR-4 mRNA的表達均明顯降低(P<0.05)，且H組改善更明顯(P<0.05)。結論阿托伐他汀對膿毒癥大鼠ALI具有保護作用，這種保護作用可能與其抑制MIP-2及TLR-4表達有關。

〔關鍵詞〕阿托伐他汀；膿毒癥；肺損傷；細胞炎性蛋白-2；Toll樣受體-4

膿毒癥極易引起急性肺損傷(ALI)〔1〕。盡管針對膿毒癥所致ALI在臨床上采用多種新型抗生素和強效血管活藥物進行治療，但其所取得的效果還很有限。有研究發現阿托伐他汀對膿毒癥ALI具有一定的保護作用〔2〕。本實驗通過應用阿托伐他汀對盲腸結扎穿孔(CLP) 模型的膿毒癥大鼠肺損傷進行干預，觀察阿托伐他汀治療后多項動脈血氣指標、肺水含量、支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量及細胞計數的變化，并檢測血清和肺組織中巨噬細胞炎性蛋白2(MIP-2)及Toll樣受體4(TLR-4)表達水平，初步探討阿托伐他汀對膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用及其相關機制。

1材料與方法

1.1動物成年健康雄性SD大鼠40只，體質量190～250 g，購于華中科技大學同濟醫學院動物飼養與研究中心。所有SD大鼠飼養于12 h晝夜交替的溫控房中適應環境，術前不禁食水。40只大鼠隨機分為假手術組(S組)、模型組(M組)、阿托伐他汀低劑量組(L組，20 mg/kg)和阿托伐他汀高劑量組(H組，40 mg/kg)，每組10只。

1.2模型構建及治療方法采用盲腸結扎穿刺術方法構建膿毒癥ALI大鼠模型，具體操作步驟參見文獻報道〔3〕。阿托伐他汀治療組術后6 h和18 h腹腔注射不同劑量(20 mg/kg、40 mg/kg)的阿托伐他汀，S、M組同時間給予等量的生理鹽水腹腔注射。

1.3標本獲取及檢測方法術后20 h處死大鼠收集血液及肺組織標本，具體方法為對大鼠進行麻醉后，經由腹主動脈置入導管抽取0.5 ml血液，隨后立即開胸取出肺組織。采用全自動血氣分析機(NOVA-K型，美國)檢測氧分壓(PaO2)水平和PaO2/吸入氧體積分數(FiO2)值。肺水含量測定具體方法：在開胸取出肺組織時立即進行稱重，取得濕重，隨后將肺組織置入80℃烤箱中烘烤至恒重后稱重，取得干重，計算二者比值得出肺水含量。支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量經由二喹啉甲酸(BCA)法進行測定，具體操作步驟參見試劑盒(Thermo公司)說明書。BALF中中性粒細胞和淋巴細胞水平檢測步驟，BALF經離心后沉淀以100 μl鹽水重懸，離心后圖片，進行瑞-吉氏染色，光鏡下計數中性粒細胞和淋巴細胞水平。

1.4酶聯免疫吸附法(ELISA)MIP-2及TLR-4 ELISA檢測試劑盒購自上海復蒙基因生物科技有限公司。嚴格按照試劑盒說明書進行操作檢測血清MIP-2及TLR-4水平。

1.5反轉錄PCR方法Trizol提取組織總RNA，反轉錄成cDNA。PCR反應條件：95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 20 s，共40個循環。引物序列：MIP-2上游引物：5′-CCTCAACGGGCAGAATCAAAG-3′，下游引物：5′-CAAGACATGAGAAAGCATGA-3′；TLR-4上游引物：5′-CCTTAAAGAAACTAAATGTGGCTCA-3′，下游引物：5′-TCTAAAGAGAGATTGACTTGGGGAT-3′；內參照GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。得到的序列行瓊脂糖凝膠電泳進行電泳鑒。紫外燈下觀察結果。密度掃描、結果分析：采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。

1.6統計學方法采用SPSS16.0 軟件進行ANOVA檢驗。

2結果

2.1動脈血氣指標檢測結果與S組相比，M組PaO2水平和PaO2/FiO2值均顯著降低(P<0.01)；L組、H組均顯著高于M組(P<0.05)，且H組顯著高于L組(P<0.05)。見表1。

2.2肺水含量和BALF中蛋白含量檢測結果與S組相比，M組肺水含量和BALF中蛋白含量均顯著升高(P<0.01)；L組、H組均顯著低于M組(P<0.05)，且H組均顯著低于L組(P<0.05)。見表2。

2.3BALF中細胞計數結果與S組相比，M組BALF中中性粒細胞和淋巴細胞水平均顯著升高(P<0.01)；L組、H組均顯著低于M組(P<0.05)，且H組均顯著低于L組(P<0.05)。見表3。

2.4血清中細胞間黏附分子(ICAM)-1及MIP-2表達水平及肺組織ICAM-1及MIP-2 mRNA表達情況檢測與S組相比，M組血清中ICAM-1、MIP-2及肺組織ICAM-1、MTP-2 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.01)；L組、H組均顯著低于M組(P<0.05)，且H組均顯著低于L組(P<0.05)。見圖1，表4。

表1　動脈血氣指標檢測結果

與S組相比:1)P<0.01；與M組相比:2)P<0.05;下表同

表2　肺水含量和BALF中蛋白含量檢測

表3　BALF中細胞計數結果

表4　血清MIP-2及TLR-4水平

圖1　ICAM-1及MIP-2表達情況檢測

3討論

ALI和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS )是目前臨床兩大高死亡率的呼吸系統疾病〔4〕。ALI患者臨床死亡率約為34%～58%。本研究結果提示通過CLP方法構建的膿毒癥大鼠肺損傷模型是成功的。同時，本研究還結果提示阿托伐他汀對膿毒癥所致ALI具有治療作用。

目前關于阿托伐他汀治療膿毒癥ALI的機制很少有文獻報道。在樹突細胞中，阿托伐他汀可通過 PI3K/Akt/Nrf2 途徑抑制血管緊張素2誘導的氧化應激和炎癥反應〔5〕。在肺動脈高壓大鼠模型中，阿托伐他汀具有抑制RhoA/Rho 激酶通路和核轉錄因子(NF)-κB通路激活的作用〔6〕。同時文獻報道，阿托伐他汀可通過調節TLR依賴性的炎癥信號通路，進而對膿毒癥發揮保護作用〔7〕。MIP-2屬于趨化因子C-X-C亞家族成員之一，研究顯示其對中性粒細胞和淋巴細胞具有很強的趨化作用〔8〕，而ALI的發生與中性粒細胞和淋巴細胞在肺組織局部的聚集關系密切。TLR是一種跨膜受體蛋白，是識別病原相關分子模式的受體。研究顯示，白藜蘆醇可通過調節TLR-4的表達而對膿毒癥大鼠ALI發揮保護作用〔9〕。據此推測阿托伐他汀可能是通過調節MIP-2及TLR-4的表達而發揮膿毒癥ALI的保護作用。

4參考文獻

1Xue M，Sun Z，Shao M，etal.Diagnostic and prognostic utility of tissue factor for severe sepsis and sepsis-induced acute lung injury〔J〕.J Transl Med，2015;13(2)：172.

2于丹，楊宇平，鐘強，等.阿托伐他汀對膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用〔J〕.新鄉醫學院學報，2013;30(4)：262-5.

3Costa MF，de Negreiros CB，Bornstein VU，etal.Murine IL-17+ Vγ4 T lymphocytes accumulate in the lungs and play a protective role during severe sepsis〔J〕.BMC Immunol，2015;16：36.

4Tsushima K，King LS，Aggarwal NR，etal.Acute lung injury review〔J〕.Intern Med，2009;48(9)：621-30.

5Ma Y，Chen Z，Zou Y，etal.Atorvastatin represses the angiotensin 2-induced oxidative stress and inflammatory response in dendritic cells via the PI3K/Akt/Nrf 2 pathway〔J〕.Oxid Med Cell Longev，2014;2014：148798.

6代麗，吳尚潔.阿托伐他汀抑制RhoA/Rho激酶活性逆轉低氧性肺動脈高壓大鼠肺動脈高壓和肺血管重構〔J〕.中南大學學報醫學版，2011;36(1)：58-63.

7Calisto KL，Carvalho Bde M，Ropelle ER，etal.Atorvastatin improves survival in septic rats：effect on tissue inflammatory pathway and on insulin signaling〔J〕.PLoS One，2010;5(12)：e14232.

8Vagima Y，Zauberman A，Levy Y，etal.Circumventing Y.pestis virulence by early recruitment of neutrophils to the lungs during pneumonic plague〔J〕.PLoS Pathog，2015;11(5)：e1004893.

9周繼紅，韋曉謀，蘭慧慧，等.白藜蘆醇對膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護作用及對HMGB1及TLR4 mRNA 表達的影響〔J〕.中藥藥理與臨床，2015;31(2)：138-9.

〔2015-01-26修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：凃靜(1975-)，女，副主任藥師，主要從事醫院藥學研究。

〔中圖分類號〕R5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3140-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.020

1華潤武鋼總醫院藥械中心

第一作者：張世應(1974-)，男，主管藥師，主要從事醫院藥學研究。