異葒草素對老年耐藥性前列腺癌的逆轉作用

李亞芹　臧學麗　馮賀達　楊　婷　章春宇

(長春醫學高等專科學校，吉林　長春　130031)

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異葒草素對老年耐藥性前列腺癌的逆轉作用

李亞芹臧學麗馮賀達楊婷章春宇1

(長春醫學高等專科學校，吉林長春130031)

〔摘要〕目的探討異葒草素對耐藥性前列腺癌的逆轉作用機制。方法利用細胞增殖檢驗試劑盒(MTS)檢測細胞活性，用流式細胞儀及Hoechst33342熒光染色檢測細胞凋亡，Western印跡檢測間質樣改變及相關蛋白。結果MTS檢測細胞活性發現單獨使用異葒草素、紫杉醇時細胞抑制率增加并不明顯，而兩者聯合可明顯增加抑制率。流式細胞儀檢測細胞凋亡顯示，當異葒草素聯合紫杉醇作用于耐藥細胞時，細胞出現明顯凋亡可達57.26%。Hoechst33342熒光染色也發現二者共同作用時細胞呈現藍色，出現細胞核固縮、致密濃染、顏色發白等凋亡特征。Western 印跡檢測E-cadherin、Notch-1表達情況，發現異葒草素能增加E-cadherin的表達，同時抑制Notch-1表達。結論異葒草素能夠逆轉前列腺癌細胞PC3-TxR的耐藥情況，其作用機制可能是通過增加E-cadherin、抑制Notch-1的表達而實現的。

〔關鍵詞〕耐藥；前列腺癌；異葒草素

前列腺癌是一種激素依賴腫瘤，為老年男性常見疾病〔1〕。異葒草素是一種黃酮類物質，在西番蓮、葒草及竹葉等植物中有豐富的含量〔2,3〕。已有研究證實異葒草素具有抗腫瘤、抗感染、抗氧化等作用〔4,5〕，但其對逆轉耐藥腫瘤的作用目前尚無報道。本研究旨在探討異葒草素對老年前列腺癌患者耐藥的逆轉作用。

1材料和方法

1.1實驗材料和儀器前列腺癌耐藥細胞株PC3-TxR由吉林大學轉化醫學院惠贈。異葒草素，上海永恒生物科技；細胞增殖檢驗試劑盒(MTS)，美國Sigma；二甲基亞硫(DMSO)，美國MP Biomedicals；RPML-1640培養基，吉諾生物醫藥技術有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，BIOBOX；胎牛血清、胎牛血清白蛋白(BCA)定量，美國Thermo Scientific；脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TBST)、四甲基乙二胺(TEMED)、瓊脂糖，國藥集團化學試劑有限公司；Hoechst33342，美國Sigma；兔抗人E-cadherin、兔抗人Notch-1、β-actin，美國Cell Signaling Technology；二抗，上海生工生物工程有限公司；PVDF膜，美國Millipore。

超凈工作臺，德國Heraeus；培養瓶，美國BD Falcon；離心機，美國Sigma；96孔板，美國Coring；酶標儀Gen5 1.10，美國BioTek；流式細胞儀，美國BD FACS Calibur；Ckx41倒置熒光顯微鏡，日本Olympus；220 V電泳供電裝置PowerPac、165-8001型伯樂小型垂直電泳、221BR Trans-Bolt SD半干轉印槽、ChemiDox XRS 凝膠成像系統，美國Bio-Rad。

1.2方法

1.2.1MTS檢測細胞活性將處于對數生長期的1×104/L PC3-TxR接種到96孔板上，每孔200 μl。置于37℃，5%CO2培養箱中24 h。棄去上清，磷酸緩沖液(PBS)洗滌1次。異葒草素組加入400 μl 40 μmol/L異葒草素；紫杉醇組加入4 mg/ml紫杉醇400 μl；混合組加入40 μmol/L異葒草素200 μl，4 mg/ml紫杉醇200 μl；空白對照組加入等量的細胞培養液。每組設5組復孔。繼續培養24、48、72 h，在結束培養前4 h向各孔中加入10 μl MTS，混勻后待實驗結束后棄去上清液，在酶標儀上檢測490 nm處的吸光值。抑制率=(1-實驗組OD值/細胞組OD值)×100%。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡情況將對數生長期的腫瘤細胞接種于培養瓶中，之后按1.2.1中分組加入藥物，作用48 h后收集細胞，常溫1 000 r/min離心5 min，棄去培養液，使用預冷PBS重懸細胞后再次按上述條件離心，重復2次。將收集的細胞用預冷75%乙醇固定。再次離心后棄去固定液，PBS洗滌2次。加入200 μl碘化丙啶(PI)，置于4℃環境25 min。400目篩網過濾1次后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.3Hoechst33342熒光染色將處于對數生長期的腫瘤細胞接種于96孔板中，每孔1×104個細胞，待細胞貼壁生長24 h后，按上述分組情況加入相應藥物。置于37℃，5%CO2培養箱中24 h。之后棄去上清液，PBS洗滌2次，以醋酸∶甲醇1∶3(V/V)室溫固定10 min。棄去固定液，加入10 μg/ml Hoechst33342染液覆蓋細胞，37℃恒溫箱中染色10 min，棄去上清液后PBS洗滌，洗掉殘留染料，避光放置，340 nm激發熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4Western 印跡將上述分組后處理的細胞進行蛋白提取，并將蛋白溶液的濃度配置為相同。配制15%分離膠，4%濃縮膠，30 g蛋白樣品上樣，調整電壓100 V電泳2 h，之后90 V電壓聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉膜90 min，室溫下牛奶封閉1 h，1∶1 000的E-cadherin、Notch-1，4℃過夜，TBST洗滌3次，5 min/次。加入1∶5 000二抗室溫下反應1 h，再次使用TBST洗滌。化學法發光反應、曝光、拍照并進行灰度值分析。

1.3統計學方法應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1MTS檢測細胞活性除異葒草素作用24 h后細胞抑制率與對照組無明顯差異外，其余各組與對照組相比對耐藥細胞的抑制率有統計學差異(P<0.05)。單純使用異葒草素或紫杉醇作用于耐藥細胞抑制率均未達到50%，但二者共同作用后抑制率明顯增加。考慮異葒草素能夠逆轉耐藥。見圖1。

圖1　MTS檢測細胞活性

2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡單獨使用異葒草素及紫杉醇作用細胞48 h后細胞凋亡率為23.54%、37.23%，均未達到50%，可見促進細胞凋亡的情況并不理想，二者共同作用后凋亡率為57.26%。可見異葒草素聯合紫杉醇后細胞的耐藥情況得到改善。

2.3Hoechst33342熒光染色當細胞發生凋亡時Hoechst33342進入細胞，細胞呈現藍色，細胞核固縮、致密濃染，顏色發白。對照組及異葒草素組的細胞藍染，但細胞核固縮及致密不明顯，此時細胞凋亡的量少。紫杉醇作用細胞后出現明顯核固縮、致密、顏色發白。當異葒草素聯合紫杉醇時上述現象更加明顯。見圖2。

2.4Western 印跡檢測對照組與紫杉醇組的E-cadherin、Notch-1表達情況一致，無統計學差異。而異葒草素組及混合組E-cadherin明顯增多，Notch-1明顯減少，與對照組相比有統計學差異(P<0.05)。見圖3。

與對照組相比：1)P<0.05圖3　Western 印跡對耐藥蛋白的檢測

3討論

由于前列腺癌起病隱匿，故患者發現時大多已進入疾病的晚期階段。目前治療前列腺癌的主要手段有雄激素阻斷、外科手術等，但治療效果平平；并且耐藥前列腺癌讓臨床治療更加困難〔6〕。

有文獻報道耐藥細胞的形態呈梭形，細胞間疏散，呈間質樣形態改變，例如肺癌、乳腺癌等〔7〕。本研究通過Western 印跡實驗證實了耐藥的前列腺癌細胞發生了間質樣形態改變，同時異葒草素可以增加E-cadherin改變這一過程。本實驗中異葒草素能夠明顯減少Notch-1的表達，從而使耐藥前列腺癌細胞對紫杉醇的敏感性增加。

4參考文獻

1 唐志柳，白潔，顧麗娜，等.2000～2010 年我國前列腺癌和乳腺癌流行狀況的系統性綜述〔J〕.中國腫瘤，2013；22(4):260-5.

2竇妍，翟延君，佟苗苗，等.HPLC 測定不同采收期葒草中葒草素、異葒草素的含量〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2012；18(2):62-4.

3Lim JH，Park HS，Choi JK，etal.Isoorientin induces Nrf2 pathway-driven antioxidant response through phosphatidylinositol 3-kinase signaling〔J〕.Arch Pharmacal Res, 2007;30(12):1590-8.

4Park HS，Lim JH，Kim HJ，etal.Antioxidant flavone glycosides from the leaves of sasa borealis〔J〕.Arch Pharm Res,2007；30(2):161-6.

5Conforti F，Rigano D，Menichini F，etal.Protection against neurodegenerative diseases of Iris pseudopumila extracts and their constituents〔J〕.Fitoterapia,2009；80(1):62-7.

6韓蘇軍,張思維,陳萬青，等.中國前列腺癌發病現狀和流行趨勢分析〔J〕.臨床腫瘤學雜志，2013；18(4):330-4.

7Chen D,Huang J,Zhang K,etal.MicroRNA-451 induces epithelial-mesenchymal transition in docetaxel-resistant lung adenocarcinoma cells by targeting proto-oncogene c-Myc〔J〕.Eur J Cancer，2014；50(17):3050-67.

〔2015-12-20修回〕

(編輯袁左鳴/騰欣航)

通訊作者：章春宇(1970-)，女，主任藥師，主要從事藥品質量控制研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3142-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.021

1長春健康教育中心

第一作者：李亞芹(1964-)，女，副教授，主要從事生物藥物研發研究。