增齡對內皮祖細胞數量和功能活性的影響及與血管內皮功能的關系

夏文豪　張　斌　梁建文　蘇　晨　張小宇　李　琰　陶　軍

(中山大學附屬第一醫院高血壓血管病科，廣東　廣州　510080)

?

增齡對內皮祖細胞數量和功能活性的影響及與血管內皮功能的關系

夏文豪張斌梁建文蘇晨張小宇李琰陶軍

(中山大學附屬第一醫院高血壓血管病科，廣東廣州510080)

〔摘要〕目的探討增齡對人外周血內皮祖細胞數量和功能活性的影響及與血管內皮功能的關系。方法入選32例健康老年人作為實驗組(老年組)和30例健康青年人為對照組(青年組)。抽取受試者外周靜脈血20 ml，采用密度梯度離心法分離提取內皮祖細胞，采用流式細胞技術比較兩組志愿者循環中內皮祖細胞數量。體外培養7 d后，分別檢測兩組志愿者內皮祖細胞體外遷移及黏附能力；通過裸鼠頸動脈拉脫模型，比較內皮祖細胞在體內皮損傷修復能力。檢測兩組志愿者血流介導的血管舒張功能(FMD)。結果與青年組相比，老年組外周血中內皮祖細胞數量明顯下降(P<0.01)，體外遷移、黏附(P<0.01)及在體再內皮化功能均明顯受損。減少的在體再內皮化面積與下降的FMD之間呈正相關。結論增齡導致外周血中內皮祖細胞數量和功能活性受損與血管內皮功能下降密切相關，是動脈粥樣硬化血管疾病發生發展的重要環節。

〔關鍵詞〕增齡；內皮損傷；內皮功能；內皮祖細胞

增齡是最常見的心血管危險因子之一，其導致的血管內皮損傷是動脈粥樣硬化血管疾病發生和發展的重要機制之一〔1,2〕。內皮祖細胞(EPCs)能定向分化為內皮細胞，修復血管內皮損傷，是血管內皮損傷修復最重要的機制之一〔3〕。然而，在心血管危險因素和疾病存在時，循環中EPCs的數量和功能逐漸下降，這種內源性血管內皮修復能力的減退是動脈粥樣硬化血管疾病發生發展的重要原因〔4,5〕。當生理性衰老發生時，血管內皮依賴舒張功能受損，而且這種血管功能障礙與循環EPCs數量減少密切相關，提示循環EPCs數量減少導致的內源性血管修復能力下降是生理性衰老血管損傷的發病機制之一〔6〕。然而，增齡對EPCs數量和功能活性的影響及與血管內皮功能之間的關系有待進一步研究。本研究主要探討增齡對EPCs數量和功能活性及血管內皮功能的影響。

1資料與方法

1.1研究對象分別招募32名老年志愿者〔年齡(68±6.6)歲〕和30名青年志愿者〔年齡(26±5.8)歲〕參與實驗，分為老年組和青年組，兩組志愿者均無心血管危險因素、心血管病史及臨床證據。本研究方案得到我院倫理委員會批準，并與所有的研究對象簽署知情同意書。基線特征均在正常范圍，老年人與年輕人之間除年齡外其余特征差異無統計學意義(表1)。

表1　兩組志愿者基線資料比較±s)

與青年組比較：1)P<0.01

1.2方法

1.2.1EPCs的分離和培養分別抽取兩組志愿者外周靜脈血30 ml，采用密度梯度離心法分離純化出外周血單個核細胞，重懸于EGM-2培養基(含20%優質胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素0.1 mg/ml、VEGF 50 ng/ml)，接種于預先包被好纖維連接蛋白(5 μg/cm2)的細胞培養瓶中，置于5% CO2，37℃培養箱中培養；3 d后移除未貼壁懸浮細胞，換培養液繼續培養；每3 d換液，在倒置顯微鏡下動態觀察細胞形態的變化，培養至7 d左右的貼壁細胞即為實驗所用的EPCs〔7〕。

1.2.2EPCs的流式細胞計數培養7 d后，將貼壁細胞消化后重懸，每1×106個分置于EP管中，分別加入PE標記的鼠抗人CD31、KDR和CD133抗體各10 μl，陰性對照管加入PE標記的同型大鼠IgG抗體10 μl，4℃避光孵育30 min，250 r/min離心5 min，棄上清液，流式細胞檢測緩沖液洗滌2次，4%多聚甲醛溶液重懸，流式細胞儀檢測CD34+/KDR+及KDR+/CD133+陽性細胞數量。采用國際上公認CD34+/KDR+或KDR+/CD133+雙陽性定義為循環內皮祖細胞。

1.2.3EPCs的體外遷移實驗培養7 d之后，將EPCs消化后重懸，將2×104個EPCs加入Boyden小室上室，置于24孔板中，在下室中加入500 μl的不含胎牛血清的EBM-2，然后加入100 ng/ml的SDF-1，將其置于5%CO2，37℃培養箱培養；24 h后取出Boyden小室，小心棄去上層液體，用棉簽小心擦掉小室濾膜孔上表面上未遷移的細胞；將Boyden小室置于4%多聚甲醛溶液中，固定10 min；熒光顯微鏡下觀察，選擇3個不同視野計數。

1.2.4EPCs的體外黏附實驗將培養的HUVECs消化、重懸，按3×105/孔接種到六孔板中，于37℃、5%CO2培養箱中培養；培養48 h后形成內皮細胞單層后，加入1 μg/ml CM-DiI染料的無血清EGM-2培養液37℃、5%CO2培養箱中培養；孵育10 min后，消化重懸；將消化重懸的內皮祖細胞按1×105/孔加入上述準備好的內皮細胞單層中，37℃、5%CO2培養箱中培養。3 h后棄去培養基，用4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min，DAPI溶液染色10 min，熒光顯微鏡下觀察，計算黏附于內皮細胞單層上的EPCs數量。

1.2.5裸鼠頸動脈拉脫損傷模型(1)手術：取8～10周齡的裸鼠，腹腔注射水合氯醛進行麻醉，頸部正中切口游離、暴露頸外動脈后，在其下穿2根5-0絲線，距離大約0.5 cm，結扎遠端(靠近頭部端)。在2根絲線間頸外動脈上剪開一小口，插入直徑0.35 mm的金屬導絲至頸總動脈，旋轉進出3次，結扎頸外動脈近端。(2)EPCs移植：將培養7 d的EPCs消化，PBS緩沖液重懸為密度5×105/100 μl的細胞懸液置于37℃(EPCs示蹤實驗時EPCs先用CM-DiI標記)，拉脫手術約3 h后裸鼠蘇醒，將上述EPCs懸液按5×105/只從尾靜脈注入裸鼠體內，對照組用不含細胞的PBS緩沖液或HUVEs注射。(3)伊文思藍染色：將手術3 d后的裸鼠麻醉，經尾靜脈注入100 μl的5%伊文思藍溶液，10 min后打開頸部正中切口分離取出雙側頸總動脈，處死動物； 將動脈條置于PBS緩沖液中漂洗干凈后縱切開，內膜朝上置于載玻片上拍照〔8〕。

1.2.6血流介導的血管舒張功能(FMD)檢測采用日本UNEXEF高分辨率超聲血管內皮分析儀分析肱動脈血流介導的內皮舒張功能。受試者在測試前4 h禁食，12 h內禁止吸煙、攝入酒精、咖啡因等，在一個安靜、溫度舒適的房間內休息至少10 min后進行FMD測量。用帶有10 MHz的H型探頭，記錄基線時的右肱動脈縱向影像；然后在超收縮壓緊壓(右側前臂，緊壓5 min，超過收縮血壓50 mmHg)、充氣囊放氣后2 min之內持續記錄二維灰度圖像和縱向平面中肱動脈的A-模型波。用心電圖R波，使之與每博肱動脈收縮直徑同步，自動跟蹤并持續記錄舒張直徑的變化。用反應性充血期間最大擴張時的直徑變化百分比(相比于基線值)估算FMD。

2結果

2.1外周血中EPCs數量與青年組〔(0.043±0.008)%、(0.04±0.01)%〕相比，老年組外周血單核細胞中CD34+/KDR+雙陽性〔(0.027±0.006)%〕和KDR+/CD133+雙陽性細胞比例〔(0.022±0.006)%〕均顯著減低(P<0.01)。

2.2EPCs體外遷移實驗結果相比于青年組〔SDF-1(-):39±6,(+):67±11〕，老年組EPCs基礎遷移水平〔SDF-1(-):28±7〕降低(P<0.05)，SDF-1誘導的遷移能力減低〔SDF-1(+):46±9〕更為明顯(P<0.001)。見圖1。

2.3EPCs體外黏附實驗結果TNF-α(-)：青年組41±6，老年組22±7;TNF-α(+):青年組77±11;老年組58±9。熒光顯微鏡計數黏附在內皮細胞單層的EPCs數量，老年組明顯低于青年組(P<0.05)，見圖2。

2.4EPCs體內再內皮化實驗結果相比于PBS組〔(12±3)%〕，青年組〔(58±9)%〕和老年組〔(34±7)%〕內皮祖細胞損傷血管內皮化面積明顯更大，老年組比青年組明顯少(P<0.01)。見圖3。

2.5增齡對血流介導的FMD的影響FMD老年組血流介導的FMD〔(6.3±1.1)%〕明顯減低(P<0.01)，青年組為(8.8±2.1)%，提示血管內皮功能受損。

2.6血流介導的FMD與內皮祖細胞內皮化的關系無論青年組還是老年組，FMD與EPCs在體內皮化面積之間存在明顯正相關(青年組：P<0.01,R2=0.692；老年組：P<0.01,R2=0.641)。見圖4。

Scale bar=100 μm圖1　EPCs外遷移能力比較(×100)

Scale bar=100 μm圖2　EPCs體外黏附能力(×100)

圖3　兩組志愿者EPCs在體內皮化能力

圖4　FMD與EPCs在體內皮化面積相關性分析

3討論

衰老引起的血管內皮損傷是動脈粥樣硬化血管疾病發生和發展的重要環節，而修復血管內皮損傷是防治缺血性血管疾病的重要措施之一。國內外研究表明：血管損傷時，內皮祖細胞能歸巢到損傷內皮局部，參與血管內皮損傷修復過程，是血管內皮損傷修復最重要的機制之一〔9～11〕。然而，在心血管危險因素和疾病的存在下，循環中內皮祖細胞的數量和功能均下降，這種內源性血管內皮修復能力的減退是動脈粥樣硬化血管疾病發生發展的重要原因〔12,13〕。

在既往的研究中，我們探討了衰老血管功能與循環內皮祖細胞數量的關系，結果發現衰老引起血管內皮依賴舒張功能受損，而且這種血管功能障礙并且與循環內皮祖細胞數量減少密切相關，提示循環內皮祖細胞數量減少導致的內源性血管修復能力下降是生理性衰老血管損傷的發病機制之一，然而血管衰老與內皮祖細胞的功能活性有待進一步研究。

本研究發現：增齡導致外周循環中內皮祖細胞數量明顯下降，培養后的內皮祖細胞體外遷移、黏附功能活性明顯降低，提示其血管內皮損傷修復能力可能減弱。通過建立裸鼠頸動脈內皮拉脫損傷模型，結果發現：與年輕人相比，老年人內皮祖細胞頸動脈內皮損傷修復的面積顯著減少，這進一步證實衰老導致內皮祖細胞的內源性修復能力的降低。

本研究結果為增齡所致心血管疾病的發生發展提供新思路，即增齡除對血管的直接損傷外，還可能間接通過減弱血管內皮功能修復機制—內皮祖細胞的數量減少和功能減退而導致血管內皮功能障礙，從而促進心血管事件的發生和發展。

4參考文獻

1Sniderman AD,Furberg CD.Age as a modifiable risk factor for cardiovascular disease〔J〕.Lancet,2008;371(9623):1547-9.

2Taddei S,Virdis A,Mattei P,etal.Aging and endothelial function in normotensive subjects and patients with essential hypertension〔J〕.Circulation,1995;91(7):1981-7.

3Asahara T,Murohara T,Sullivan A,etal.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis〔J〕.Science,1997;275(5302):964-7.

4Schmidt-Lucke C,R?ssig L,Fichtlscherer S,etal.Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair〔J〕.Circulation,2005;111(22):2981-7.

5Vasa M,Fichtlscherer S,Aicher A,etal.Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease〔J〕.Circ Res,2001;89(1):e1-7.

6Tao J,Jin YF,Yang Z,etal.Reduced arterial elasticity is associated with endothelial dysfunction in person of advancing age:comparative study of noninvasive pulse wave analysis and laser Doppler blood flow measurement〔J〕.Am J Hypertens,2004;17(8):654-9.

7Tao J,Yang Z,Wang JM,etal.Shear stress increases Cu/Zn SOD activity and mRNA expression in human endothelial progenitor cells〔J〕.J Hum Hypertens,2007;21(5):353-8.

8Chen L,Wu F,Xia WH,etal.CXCR4 gene transfer contributes to in vivo reendothelialization capacity of endothelial progenitor cells〔J〕.Cardiovasc Res,2010;88(7):462-70.

9Giannotti G,Doerries C,Mocharla PS,etal.Impaired endothelial repair capacity of early endothelial progenitor cells in prehypertension:relation to endothelial dysfunction〔J〕.Hypertension,2010;55(6):1389-97.

10Lamping K.Endothelial progenitor cells sowing the seeds for vascular repair〔J〕.Circ Res,2007;100(9):1243-5.

11Steinmetz M,Nickenig G,Werner N.Endothelial-regenerating cells:an expanding universe〔J〕.Hypertension,2010;55(3):593-9.

12Zhang XY,Su C,Cao Z,etal.CXCR7 upregulation is required for early endothelial progenitor cell-mediated endothelial repair in patients with hypertension〔J〕.Hypertension,2014;63(2):383-9.

13Fadini GP,de Kreutzenberg S,Albiero M,etal.Gender differences in endothelial progenitor cells and cardiovascular risk profile:the role of female estrogens〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008;28(5):997-1004.

〔2015-12-14修回〕

(編輯徐杰)

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81200249)；廣東省科技計劃項目(2016A020215056)；中山大學附屬第一醫院優秀青年人才計劃(2012年)；中山大學青年教師培育項目(2014年)

通訊作者：陶軍(1961-)，男，教授，博士，博士生導師，主要從事動脈粥樣硬化性心血管疾病研究。

〔中圖分類號〕R543.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3149-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.024

Effects of aging on the number and functional activity of endothelial progenitor cells and the relationship between vascular endothelial function

XIA Wen-Hao, ZHANG Bin, LIANG Jian-Wen,et al.

Department of Hypertension and Vascular Disease, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of aging on the quantity and functional activities of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) in healthy men.Methods32 healthy old people〔elderly group:(68±6.6) years old〕 and 32 healthy young people〔young group:(26±5.8) years old〕were enrolled into the research.EPCs were isolated and cultured from peripheral blood by density gradient centrifugation method, and the quantity of circulating EPCs was exterminated by flow cytometry analysis.Further, the migration and adhesion function in vitro and the reendothelialization capacity in vivo of EPCs from two groups subjects were measured.Moreover, the flow-mediated dilatation of two group subjects were exterminated.ResultsCompare with those of young group, the quantity (P<0.01), in vitro migration and adhesion (P<0.01) and in vivo reendothelialization capacity (P<0.001) of EPCs from aging group were significant declined.And the impaired endothelial repair capacity was positive relation with declined FMD.ConclusionsAge-related decline in quantity and function of human EPCs is close relation with decreasing endothelial function, which is an important risk factor for atherosclerotic vascular diseases.

【Key words】Aging;Endothelial injury;Endothelial function;Endothelial progenitor cells

·心、腦血管及代謝性疾病·

第一作者：夏文豪(1978-)，男，主治醫師，主要從事老年心血管疾病的基礎與臨床研究。