乳腺癌組織中乳腺癌1號(hào)基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)的關(guān)系

李冬霞　蔡曉燕　高建芝

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南　新鄉(xiāng)　453003)

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乳腺癌組織中乳腺癌1號(hào)基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)的關(guān)系

李冬霞蔡曉燕高建芝

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

〔摘要〕目的研究乳腺癌組織中乳腺癌1號(hào)基因(BRCA1)啟動(dòng)子甲基化與蛋白的表達(dá)情況，并分析BRCA1啟動(dòng)子甲基化及蛋白表達(dá)與乳腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系。方法應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)和免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)48例患者乳腺癌組織、癌旁乳腺組織中BRCA1啟動(dòng)子甲基化及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果乳腺癌組織中BRCA1啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率(27.1%)明顯高于其癌旁乳腺組織(0，P<0.05)；BRCA1啟動(dòng)子甲基化與乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；乳腺癌組織中BRCA1蛋白陽(yáng)性率(54.2%)明顯低于其癌旁乳腺組織(100%，P<0.05)；BRCA1蛋白的表達(dá)與乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；BRCA1啟動(dòng)子甲基化與蛋白表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論BRCA1啟動(dòng)子的異常甲基化是引起蛋白表達(dá)缺失的原因之一，BRCA1蛋白表達(dá)缺失與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕乳腺癌；乳腺癌1號(hào)基因(BRCA1)；甲基化；免疫組織化學(xué)

乳腺癌1號(hào)基因(BRCA1)是一個(gè)與乳腺癌相關(guān)的抑癌基因，參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、蛋白泛素化及DNA損傷修復(fù)等過(guò)程。BRCA1表達(dá)異常時(shí)導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯和遺傳不穩(wěn)定性。本文研究乳腺癌組織中BRCA1基因啟動(dòng)子甲基化及蛋白的表達(dá)與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并分析BRCA1基因啟動(dòng)子甲基化與蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1一般資料新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2010～2011年乳腺癌手術(shù)切除標(biāo)本48例(每例標(biāo)本取材均包括癌組織、癌旁相對(duì)應(yīng)的正常組織，后者選取距癌組織5 cm、肉眼觀相對(duì)正常處，所有患者術(shù)前均未行放、化療)。均為女性，年齡24～83〔平均(49.32±1.32)〕歲。最后確認(rèn)癌旁對(duì)應(yīng)的基本正常組織27例。上述標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)師證實(shí)。

1.2甲基化特異性PCR(MSP)利用切除后的標(biāo)本提取患者的基因組DNA，經(jīng)過(guò)純度檢測(cè)及定量分析后，采用亞硫酸氫鈉修飾，然后純化回收，-20℃冰箱低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。BRCA1啟動(dòng)子區(qū)域的引物參考文獻(xiàn)〔1〕設(shè)計(jì)，由大連寶生物公司合成。甲基化引物：上游為5'-TCGTGGTAACGGAAAAGCGC-3'，下游為5'-AACGAACTCACGCCGCGCAA-3'；非甲基化引物：上游為5'-TTGAGAGGTTGTTGTTTAGTGG-3'， 下游為5'-AACAAACTCACACCACACAA-3'。反應(yīng)總體系25 μl，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，甲基化引物62℃退火30 s，非甲基化引物55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min。取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。若擴(kuò)增出68 bp大小的片段，提示BRCA1啟動(dòng)子甲基化；若擴(kuò)增出100 bp的片段，提示BRCA1啟動(dòng)子未發(fā)生甲基化；既能擴(kuò)增出68 bp的產(chǎn)物，又能擴(kuò)增出100 bp的片段，提示為部分甲基化。

1.3免疫組化切除后的標(biāo)本甲醛固定后石蠟包埋，然后4 μm厚連續(xù)切片。兔抗人BRCA1單克隆抗體(1∶50的工作濃度)購(gòu)于北京中杉金橋公司，應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)BRCA1蛋白的表達(dá)。BRCA1陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核染成棕黃色或者棕褐色。BRCA1染色結(jié)果按文獻(xiàn)〔2〕。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)性分析。

2結(jié)果

2.1BRCA1啟動(dòng)子甲基化乳腺癌組織中BRCA1啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率(27.1%)明顯高于其癌旁乳腺組織(0，P<0.05)，見(jiàn)圖1；BRCA1啟動(dòng)子甲基化與乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，但與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小及臨床分期無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2BRCA1蛋白的表達(dá)乳腺癌組織中BRCA1蛋白陽(yáng)性率(54.2%)明顯低于其癌旁乳腺組織(100%)，見(jiàn)圖2。BRCA1蛋白表達(dá)與乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，但與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小及臨床分期無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

4,9均為乳腺癌組織；U：未甲基化；M：甲基化圖1　BRCA1基因啟動(dòng)子甲基化

臨床病理參數(shù)n甲基化陽(yáng)性(n=13)P值BRCA1表達(dá)陽(yáng)性(n=26)P值年齡(歲) <502660.497160.265 ≥5022710腫瘤最大直徑(cm) 2～53170.543180.464 >51768組織學(xué)分級(jí) Ⅰ級(jí)1820.023130.025 Ⅱ級(jí)20511 Ⅲ級(jí)1042臨床分期 Ⅰ、Ⅱ期3480.613170.367 Ⅲ、Ⅳ期1499淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23100.01480.010

2.3BRCA1啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化與蛋白表達(dá)的關(guān)系22例BRCA1蛋白陰性病例中，12例BRCA1啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化，26例BRCA1蛋白陽(yáng)性病例中，1例BRCA1啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化，BRCA1蛋白表達(dá)與BRCA1啟動(dòng)子甲基化呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

圖2　乳腺癌組織中BRCA1蛋白陽(yáng)性表達(dá)(SP，×200)

3討論

BRCA1是具有遺傳傾向的乳腺癌和卵巢癌的易感基因，該基因定位于人17q21染色體，全長(zhǎng)約100 kb，含有22個(gè)編碼外顯子、2個(gè)非編碼外顯子，編碼一個(gè)含有1 863個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白。BRCA1蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡及泛素化等細(xì)胞活動(dòng)，尤以DNA損傷修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)最為重要。BRCA1突變或發(fā)生缺陷將導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)不穩(wěn)，使細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化的敏感性增加，同時(shí)損傷修復(fù)功能降低，最終發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化〔3〕。BRCA1突變的頻率和類(lèi)型與種族、地域等有一定的關(guān)系〔4〕。Suilkerbuijk等〔5〕在研究BRCA1突變的種系發(fā)現(xiàn)，其甲基化狀況不依賴于年齡，雌激素受體(ER)和淋巴轉(zhuǎn)移的狀況。Ma等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織BRCA1啟動(dòng)子甲基化率明顯高于癌旁病變組織和良性病變組織，BRCA1基因啟動(dòng)子甲基化與散發(fā)性乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)及ER相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，BRCA1啟動(dòng)子高甲基化水平與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，BRCA1基因啟動(dòng)子異常甲基化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；BRCA1蛋白在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，BRCA1蛋白表達(dá)降低與腫瘤細(xì)胞的惡性程度密切相關(guān)。腫瘤組織中BRCA1啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生高甲基化，引起相應(yīng)區(qū)域的組蛋白去乙?；昂诵◇w空間排列分布改變，從而使轉(zhuǎn)錄抑制蛋白的功能增強(qiáng)，轉(zhuǎn)錄抑制而失表達(dá)。本文提示BRCA1蛋白表達(dá)失活的原因除了BRCA1基因啟動(dòng)子甲基化之外，還存在其他的失活機(jī)制。

綜上，BRCA1啟動(dòng)子的高甲基化是導(dǎo)致其蛋白表達(dá)缺失的原因之一，BRCA1蛋白表達(dá)缺失與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。這提示可以以BRCA1為治療靶點(diǎn)，用甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑對(duì)乳腺癌進(jìn)行基因治療。

4參考文獻(xiàn)

1Wu L,Cao WH,Chen QF.Study in BRCA1 gene methylation status and mRNA expression level in sporadic breast cancer〔J〕.J Surg Concepts Pract,2011;16(6)：576-80.

2Xu GH,Li Y,Ye SL,etal.ERCC1 and BRCA1 expressions in the tissues of colorectal cancer and its relationship with clinical significance of platinum-based chemotherapy〔J〕.Fudan Univ J Med Sci,2011;38(4):315-8.

3李小剛,王家宏.BRCA1與乳腺癌研究進(jìn)展〔J〕.包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012;28(5):130-3.

4Smith KL,Adank M,Kauff N,etal.BRCA mutations in women with ductal carcinoma in situ〔J〕.Clin Cancer Res,2007;13(14):4306-10.

5Suilkerbuijk KP,Fackler MJ,Sukumar S，etal.Methylation is less abundant in BRCA1-associated compared with sporadic breast cancer 〔J〕.Ann Oncol,2008;19(11):1870-4.

6Ma WH,Hou L,Han LL.Methionine synthase and methylation of BRCA1:their association with breast cancer morbidity〔J〕.Chin Oncol,2011;21(4):256-61.

〔2015-04-16修回〕

(編輯杜娟)

基金項(xiàng)目：河南省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2008B310005)

通訊作者：高建芝(1968-)，女，副教授，博士，主要從事腫瘤發(fā)病機(jī)制研究。

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R737.9

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)13-3195-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.048

第一作者：李冬霞(1977-)，女，講師，碩士，主要從事腫瘤發(fā)病機(jī)制研究。