CRISPR/Cas9基因編輯系統研究進展及其在動物基因編輯研究中的應用

王瑋瑋，劉瑞琪，吳勇延，楊嚴格，王勇勝，卿素珠

(西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100)

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CRISPR/Cas9基因編輯系統研究進展及其在動物基因編輯研究中的應用

王瑋瑋，劉瑞琪，吳勇延，楊嚴格，王勇勝，卿素珠*

(西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100)

摘要：CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)系統是由一種短小RNA調控的對DNA修飾的基因編輯工具，是一種較鋅指核酸酶(Zinc-fingers nuclease，ZFN)和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(Transcription activator-like (TAL) effector nucleases，TALEN)打靶更加快速、高效、精準的新型基因組編輯工具，它易于設計，且具有特異性。本文回顧了CRISPR/Cas系統的結構與功能，概述了Cas9的設計策略、影響Cas9基因編輯效率的因素、脫靶檢測分析方法及其在動物基因編輯研究中的應用。基于CRISPR/Cas9已經在多種動物上成功實現了基因編輯，它有望成為建立動物模型和研究疾病防治的一種新型可行性途徑。

關鍵詞：CRISPR/Cas9系統；基因編輯；sgRNA；基因敲除；基因敲入；動物模型

1CRISPR/Cas的興起

1987年，日本科研人員[1]在大腸桿菌的基因組中發現了一系列相互間隔的短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)，這種短回文序列可以給細菌與古細菌提供獲得性免疫[2]，當時有研究者預測了 CRISPR/Cas可能是一種新的DNA修復系統[3-4]。CRISPR/Cas系統廣泛存在于原核生物中，87%的古細菌和48%的細菌中都含有此種蛋白免疫系統[5]。最初，CRISPR/Cas系統無法應用在人和動物上，經過改造，它作為一種以核酸酶為核心的基因編輯技術逐漸被廣泛應用。

2CRISPR/Cas9系統的基因結構和作用機制

2.1CRISPR/Cas9系統的基因結構

目前有3種CRISPR/Cas系統(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，Cas9核酸蛋白酶主要構成和表達Ⅱ型CRISPR/Cas系統。每個系統包含一群與CRISPR相關的基因、非編碼RNA和一個獨特陣列的正向重復元件，其中最常見是的肺炎鏈球菌S.pneumoniaeCas9(spCas9)系統，即Ⅱ型CRISPR/Cas9系統。CRISPR/Cas9系統至少需要3個組件：一個CRISPR相關核酸酶、一個特異性CRISPR RNA(CRISPR RNAs，crRNA)和一個反式激活CRISPR RNA(Transactivating crRNA，tracrRNA)[6]。有研究人員為了精簡這一技術，設計出了代替crRNA- tracrRNA復合物的單鏈向導RNA(Singleguide RNA，gRNA)[7]，它可以將Cas9核酸酶引導到目標打靶位點對雙鏈DNA進行切割。此外，tracrRNA上還有一個結構叫做tracrRNA尾巴(TracrRNA tail)，該結構有利于增強Cas9核酸酶的表達[8]。

CRISPR是一些相互間隔的短回文重復序列，序列長度為21～48 bp，這些重復序列常常產生發卡結構，而且發卡結構的重復次數可達200次以上[5]。每個重復序列都被外源性DNA靶點中與之結構相似的短重復序列所隔開，叫做典型間隔區域(Protospacer)，這些間隔區域序列決定了CRISPR系統的種類以及靶基因的識別位點[9]。在DNA靶點之內，每個典型間隔區域始終與典型間隔相鄰基序(Protospacer adjacent motif，PAM)相鄰，PAM可以根據特異性CRISPR系統而變化[10]。常用的PAM有3種類型，分別為NGG、NAG和NNGG[11]。Cas9蛋白含有兩個核酸酶結構域，一個是HNH結構域，另一個是RuvC樣結構域。HNH核酸酶結構域和RuvC樣核酸酶結構域分別切割目標DNA鏈的一條單鏈[12]。這樣的單鏈切割容易產生突變，可能是由于HNH和RuvC的存在[13]。

2.2CRISPR/Cas9系統的作用機制

如圖1所示，PAM序列引起Cas9蛋白識別，使得與tracrRNA相連的單鏈向導RNA(Single guide RNA，sgRNA)與目標位點(Target sequence)識別，保證了Cas9蛋白和基因組穩定地結合，引起目標位點的切割，從而產生DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks，DSB)[14]。DNA雙鏈斷裂后引起非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)或者同源性定向修復(Homology-directed repair，HDR)，各個單鏈通過高精確度的堿基切除修復機制(Base-excision repair，BER)進行修復[15-16]。CRISPR/Cas9系統可以同時對靶基因進行高效的基因敲除(Knockout)和基因敲入(Knock-in)編輯，如圖2所示，只需對目的片段進行切割，通過NHEJ機制修復而引入插入或缺失的突變，就可以達到Knockout的效果。Knock-in則是將外源有功能的基因轉入基因的同源序列中，通過HDR修復，進行Knock-in或者點突變，使插入基因組得以在細胞內表達[17]，高效地對特定位點同時進行Knockout和Knock-in是Cas9系統的一種特色，只需要改變供體載體(Donor vector)上的外源基因即可。

圖1　CRISPR/Cas9系統的作用機制Fig.1　Mechanism of CRISPR/Cas9 system

2.3Cas9與傳統技術的對比

早期的基因編輯技術主要有鋅指核酸酶(ZFNs)和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)。ZFNs是由鋅指序列組成，FokI核酸酶結構域通過二聚體作用產生核酸內切酶活性從而切開DNA雙鏈。轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)與 ZFNs的構建原理相似，設計更加優化，靶向特異性更加明確。CRISPR/Cas9系統作為第3代的人工核酸酶技術，與ZFNs和TALENs相比，其優勢在于打靶位點多，平均8個堿基就有一個打靶位點，ZFNs幾乎到500個堿基才有一個合適的打靶位點[18]。其次是Cas9載體構建簡單，只需根據特異性打靶位點設計sgRNA，而ZFNs 和TALENs則需要對每個打靶位點設計和組裝一對核酸酶。再者就是Cas9可以高效地進行多位點編輯，而ZFNs和TALENs的一對核酸酶一次只能切割一個位點，很難提高突變率。但是Cas9的脫靶率要高于ZFNs和TALENs[19]。

圖2　Cas9核酸酶的切割和修復機制[17]Fig.2　Cleavage by nucleases and repair mechanism of Cas9 nucleases

3Cas9的設計策略

3.1單鏈向導RNA的設計

sgRNA從5′開始到3′依次為DNA互補區、crRNA和tracrRNA，其中DNA互補區的設計對打靶效率有至關重要的影響[20]。sgRNA中有一個12個堿基組成的毗鄰PAM上游的獨特序列，被稱作“種子區”[21]，“種子區”發生錯配對靶位點的識別影響更大[22]。sgRNA和目的片段之間一定數量的錯配是可以被容忍的，特別是當這些錯配離PAM較遠的情況下[23]，因此在設計sgRNA時需要注意發生錯配的序列位置。針對基因組設計sgRNA的一般標準是：緊鄰著PAM序列(5′-NGG-3′)的12個堿基的種子區的3′端最多允許出現1個錯配；在單鏈向導RNA(sgRNA)5′末端8個堿基的區域允許出現5個錯配[21]。總的來說就是要嚴格遵守堿基互補原則來設計靠近PAM的12個堿基序列，盡量保證該序列內沒有突變或者錯配。但是相對于前人的研究，第7到第12個堿基也沒有一些特別的序列[24-25]。也有研究表明，增加莖環結構和3′尾部結構可以加強向導RNA的穩定性，有利于Cas9形成正確構象[26]。

3.2關于DNA打靶序列

目前仍然不能確定設計打靶序列的精確標準[27]，只是根據一些常規標準，在眾多打靶位點中選擇出較好的打靶位點。目前設計打靶序列的在線軟件：http：//zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx、http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html、http：//www.rgenome.net/，http：//crispr.mit.edu/、https：//chopchop.rc.fas.harvard.edu/。這幾款在線軟件中，前兩個的主要功能是尋找打靶序列，之后需要進行人工篩選，結果較為可靠。http：//www.rgenome.net/ 這個軟件可用來尋找打靶序列并且設計向導RNA，而且還可以設定所需的堿基錯配數。http：//crispr.mit.edu/和https：//chopchop.rc.fas.harvard.edu/可以對生成的sgRNA進行排名以供選擇，唯一不足是其數據庫內的物種有限[28]。

3.3影響Cas9打靶效率的因素

設計向導RNA時，GC含量一般為45%～60%為宜，超過這個范圍都會影響Cas9的靶向效率以及C堿基富集[29]。C堿基富集使得容易打靶在DNA甲基化的位置，盡量避開甲基化位點有利于減少表觀遺傳突變。但是與之矛盾的是有研究指出甲基化只影響ZFNs和TLAENs，并不影響Cas9的切割效率[8]。DNA聚合酶I超敏感位點(DHS)屬于染色質結構的一種狀態，可以顯著提高轉錄因子結合位點的細胞特異性預測，將靶向序列設計在DHS內可提高基因編輯效率[30]。此外，選擇靶向位點時，盡量選擇外顯子區域而非內含子區域，這是因為內含子對翻譯產物的意義不大且比外顯子更易產生突變。

4切割效率和脫靶效應的分析及檢測

人工設計的核酸酶經常會產生脫靶切割，在基因序列中引起突變(插入、缺失、倒置或易位)，從而使基因異常表達、細胞死亡或發生腫瘤。20 nt 的sgRNA與目的片段之間一定數目的錯配數導致大量的脫靶突變產生[31]，因此很難徹底和有效地確認潛在的脫靶位點。體外試驗表明，不同類型的PAM可能會影響CRISPR/Cas9的切割活性，按照PAM的要求，在基因組上可以產生很大的打靶范圍，打靶位點過多會導致基因片段在多個位點被切斷，這也是Cas9容易脫靶的主要原因。

4.1檢測切割效率和脫靶效應的主要手段

檢測切割效率和脫靶效應的主要手段：1.SURVEYOR法或T7EN1酶切法。兩種方法都屬于利用核酸內切酶檢測脫靶情況。SURVEYOR酶是CEL-I錯配特異性核酸酶的一種，能準確切割異源雙鏈DNA錯配位點。T7EN1酶能識別并切割不配對的雙鏈DNA，將基因編輯后序列與基因編輯前序列相比較，看一定范圍內堿基序列是否發生變化。2.SSA報告載體檢測法。該方法是建立SSA報告載體，報告載體上Luciferase蛋白失去活性后，在目標位點發生打靶后通過比對Luciferase的活性，評價核酸內切酶的切割效率和脫靶情況[32]。該法是較為精密的測試脫靶效應的方法。3.Sanger測序法。直接性地對PCR產物進行測序或者間接性地轉入TA克隆載體中，挑選單克隆進行測序。4.Digenome-Seq技術。提取基因組后進行高通量測序，它屬于全基因測序的一種方法，可以全面有效地檢測脫靶效應[33]。

4.2降低脫靶效率的方法

目前，可通過3個方面來降低Cas9基因編輯中的脫靶效應[8]：第一，提高sgRNA的特異性：(1)盡量降低預測的脫靶位點與sgRNA之間的配對堿基數；(2)設計的sgRNA與預測的脫靶位點在“種子區”至少有2個堿基的錯配；(3)盡量避免出現sgRNA與預測的脫靶位點序列有連續的或間隔的4個堿基配對。S.W.Cho等[34]的研究證明修飾sgRNA可以降低Cas9的脫靶效應。(4)縮短sgRNA的長度。將20 nt的sgRNA改造成17～18 nt的縮短型sgRNA，有效地降低了脫靶率[35]。第二，改造Cas9蛋白。F.A.Ran等致力于改造更高特異性的Cas9蛋白，將Cas9蛋白改造為雙切口酶(Double-nicking)，將Cas9切口酶突變體與成對的sgRNA相結合產生一種新的復合蛋白以完成特異性雙鏈斷裂[31]。第三，還可以將Cas9-D10A切口酶與一對sgRNA配合使用產生SSB(Single-strand breaks，SSB)，以減少因細胞核內不存在DNA同源修復模板而引起的脫靶突變[36]。

5Cas9在動物基因編輯研究上的應用

5.1基因敲除

2013年，美國科研工作者基于CRISPR/Cas9技術在細胞系上進行基因敲除，利用靶位點特異性RNA，將Cas9核酸酶引導到基因組的目的位點上進行切割并引起突變。以小鼠為動物模型的Cas9基因打靶技術已經革新為“一步法”，該法可實現多重基因組編輯[37]。H.Wang等[38]選擇對Tet家族基因(Ten-eleven translocation family members)進行敲除，Tet基因的突變可以引起多種腫瘤尤其是造血系統腫瘤。研究人員用顯微共注射方法，將Cas9 mRNA和sgRNA共同注射到小鼠受精卵中同時敲除Tet1和Tet2，經驗證敲除效率在80%左右，該試驗成功地產生雙等位基因突變的小鼠，并且是首次在動物體內同時敲除2個內源性基因。

Y.Niu等選擇Ppar-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)和Rag1(Recombination activating gene 1)兩個靶基因，將Cas9 mRNA和單鏈向導RNA共同注入食蟹猴受精卵中，在一個步驟中同時打靶這2個基因，在全基因分析檢測中沒有發現脫靶現象，最后成功獲得了經過基因修飾的轉基因食蟹猴[39]。靈長類動物在遺傳特性和生理功能方面與人類接近，可以作為研究模型來進行人類某些疾病致病機制及治療策略的研發。

F.Chen等[40]利用CRISPR/Cas9系統敲除豬免疫球蛋白M(IgM)重鏈基因的JH區域(Joining chain)，此區域對免疫系統的發育和分化有至關重要的作用。在體細胞核移植技術的支持下，將IgM抗體的Cas9質粒轉染仔豬胎兒成纖維細胞后，基因敲除的效率高達53.3%，其中25%陽性克隆有雙等位基因修飾，這比傳統的同源重組效率高很多[41]。X.Zhou等人采用Cas9/sgRNAs的方式，敲除了豬胎兒成纖維細胞上PARK2基因(Parkin2)和PINK1基因(PTEN-induced putative kinase 1)，以突變型細胞克隆為體細胞移植的供體，產生純合子的轉基因豬[42]。MSTN基因(Myostatin)編碼的氯化筒箭毒堿會抑制肌肉的分化和生長，研究人員利用CRISPR/Cas9技術將特異性MSTN基因的CRISPR/Cas9 mRNA顯微共注射到綿羊受精卵的胞質中，結果顯示胚胎發育突變率達50%[43]。在山羊上，在成纖維細胞敲除MSTN和FGF5基因的效率都是60%，而在98只試驗動物中分別敲除了MSTN和FGF5基因后存活下來的動物只有15%和21%，雙基因修飾后存活下來的動物為10%[44]，這些研究提示CRISPR/Cas9系統可作為動物優質性狀新品種培育和抗病育種有效的基因編輯工具。通過注射IL2RG和Rag1基因的Cas9 mRNA和sgRNA到原核期胚胎的細胞質中，可獲得高達100%效率的雙等位基因敲除兔，同時敲除3個基因(IL2RG，RAG1和RAG2)和5個基因(IL2RG，RAG1，RAG2，TIKI1和ALB)的效率均可達到33.3%[45]。N.Véron等運用活體點穿孔技術，有效敲除雞胚胎干細胞中的轉錄因子PAX7(Paired box 7)，使野生型多細胞動物產生鑲嵌式基因突變[46]，使雞胚胎干性基因的相關功能丟失。Cas9技術在斑馬魚上也實現了高效率的多基因修飾，crRNA-tracrRNA-Cas9蛋白質復合物使內源基因表達可視化，這是在冷水動物模型上的首次突破[47]。

5.2基因敲入

有研究發現如果提供同源DNA，可將外源性序列定點敲入到斑馬魚胚胎的特定靶點，插入效率為3.5%～15.6%[48]。潛在脫靶位點的突變率只有1.1%～2.5%，體現了Cas9系統的特異性。截至目前，利用Cas9系統編輯牛基因組的相關文章屈指可數，可能是因為牛較長的妊娠周期和Cas9易于脫靶的性質[49]。2016年，研究者利用NHEJ途徑有效地將一個4.6 kb的無啟動子載體整合到GADPH基因位點上，在人體細胞和胚胎干細胞上的敲入率分別為20%和1.7%，并且證明NHEJ途徑比HDR途徑的敲入效率要高[50]，但并沒有評估NHEJ途徑可能引起的細胞毒性問題。

6結語

Cas9系統是微生物自我保護的一種獨特機制，這種保護機制是為了防止外來微生物的侵入[51]。它是繼ZFN和TALEN之后出現的更為快捷和有效的基因編輯工具，該技術旨在提高對特異性序列的識別與結合的能力以及酶切效率，越來越多的研究利用Cas9系統提高了基因編輯在不同物種上的可能性。由于Cas9核酸酶的PAM(5′-NGG-3′)很短，幾乎在任何物種上都可以找到，這就解決了基因編輯工具在跨物種方面的難題，其他基因編輯工具并不能直接做到。高效、時間成本低、一個基因組上可進行多個基因位點編輯以及基本不受物種限制都是Cas9基因編輯技術異軍突起的優勢。當然，CRISPR/Cas9基因編輯技術也存在著一些不足，如容易脫靶且潛在脫靶位點多、基因突變以及影響打靶效率的因素過多等。脫靶和影響打靶效率的因素尚可預測，但基因突變是難以預測的。基因編輯過程中產生的基因突變是CRISPR/Cas9打靶系統的副作用，Cas9核酸酶可能會結合到意想不到的位點，導致某些位點發生基因突變。這些都是Cas9系統需要改進的方面。

研究者們也在致力于不斷探索和優化CRISPR系統的研究，以使其更加快捷、簡便、完善。I.M.Slaymaker等在金色葡萄球菌中找到了比Cas9核酸酶更小的一種蛋白，它的強大在于更易進入成熟細胞以及更容易切割產生黏性末端以增加DNA序列與載體間的連接[52]，隨后該團隊又在2016年改造出新型eSpCas9(“Enhanced specificity”，SpCas9)基因編輯系統，eSpCas9既降低了脫靶效率又延續了高效、高準確度打靶效率[53]。相信隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術的不斷優化和完善，其在動物基因編輯研究中的應用將更為廣泛，在動物新品種培育、抗病育種及生物醫學領域的疾病研發方面發揮重要作用。

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(編輯郭云雁)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.001

收稿日期：2016-01-08

基金項目：陜西省農業科技創新與攻關項目(2014K02-05-01)；2015年西北農林科技大學第二批基本科研業務費科技創新專項(Z109021566)

作者簡介：王瑋瑋(1990-)，女，甘肅蘭州人，碩士生，主要從事動物組織胚胎學方面的研究，E-mail：weiweiwang1990@163.com *通信作者：卿素珠，主要從事動物組織胚胎學及生殖內分泌調控研究，E-mail：suzhuqing@163.com

中圖分類號：S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1299-07

The Progress of CRISPR/Cas9 System and Its Application in Animal Genetic Engineering

WANG Wei-wei，LIU Rui-qi，WU Yong-yan，YANG Yan-ge，WANG Yong-sheng，QING Su-zhu*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

Abstract:CRISPR/Cas (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)) system is a DNA modified gene editing tools regulated by a kind of short RNA.This technology is a novel tool，which is more rapid，efficient and accurate than ZFN (zinc-fingers nuclease) and TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases) in genetic engineering.It is easy to be designed and has specificity.This paper reviews the structure and function of CRISPR/Cas9 system and the design strategy of Cas9 and its application in animal genetic engineering.CRISPR/Cas9 is successfully used in a variety of animal genetic editing，it is likely to become a new way to establish animal models and to develop a new feasible approach to prevent disease.

Key words:CRISPR/Cas9 system；genetic engineering；sgRNA；gene knockout；gene knock-in；animal models