大孔樹脂固定化磷脂酶D

劉倩倩，　邱永乾，　劉炯欽，　孫建安，　薛長湖，　毛相朝

中國海洋大學食品科學與工程學院， 山東 青島 276000

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大孔樹脂固定化磷脂酶D

劉倩倩，邱永乾，劉炯欽，孫建安*，薛長湖，毛相朝

中國海洋大學食品科學與工程學院， 山東 青島 276000

摘要：磷脂酶D( PhospholipaseD, EC3.1.4.4 , PLD)是催化磷酸酯鍵水解和堿基交換反應的一類酶的總稱。利用PLD的轉堿基作用是目前催化合成磷脂酰絲氨酸(PS)的最佳途徑。本實驗以5種大孔樹脂為載體固定化磷脂酶D(PLD)進行了研究。以酶回收率為主要指標，選擇了最佳載體和優化了固定化條件。結果表明：非極性陽離子交換樹脂H103是最佳固定化載體；其最優固定化條件：加酶液量1.2 mL，固定時間80 min，pH 6.0檸檬酸-檸檬酸鈉的緩沖液濃度為10 mmol/L。最佳固定化條件下，固定化之后的PLD比游離PLD酶活提高了三倍。

關鍵詞：磷脂酶D； 固定化； 大孔樹脂

磷脂(PL)是一種兩親水脂分子，含有一個親水性的磷酸酯(hydrophilic head)和兩個疏水性的長鏈脂肪酸(hydrophobic tail)[1]。磷脂是細胞膜的重要成分，在植物種子、禽類的蛋黃動物內臟及大腦中含量豐富，具有保濕、乳化、抗氧化等生理功能[2]。磷脂狹義上是指磷脂酰膽堿(Phosphatidyleholin, PC)，廣義上是磷脂類混合物的總稱。根據磷脂所含有磷脂酰基的不同可將磷脂分為：磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl-ethanolamin,PE)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PL)、磷脂酸絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycero,PG)和神經鞘磷脂(Springmyehn,SM)[3]。磷脂酰絲氨酸(PS)是磷脂中一種天然的稀有磷脂，能控制和調節細胞膜關鍵蛋白的功能狀態[4]，維持細胞的內部環境，在信號轉導以及分泌小泡釋放中具有重要作用[5]。臨床研究表明，PS具有重要的營養和生理功能，特別是在預防阿爾茨海默氏癡呆，改善記憶，提高警惕和關注，緩解抑郁和減少壓力等方面[6, 7]。磷脂酰絲氨酸(PS)是一種尤其重要的磷脂，對生命活動的進行具有重要的作用，但是自然界中PS含量很低，目前獲得PS的方法主要是生物提取法和酶轉化法。早期的PS主要從植物種子和動物細胞中提取，但是植物種子中的PS含量極低，提取法主要是集中在動物組織大腦和肝臟等。最近幾年，由于瘋牛病[8]的影響，從動物組織中提取PS，受到人們的質疑[9]。酶轉化法制備PS主要是利用天然的大豆磷脂和絲氨酸為底物，在磷脂酶D的催化作用下，通過磷脂酶D的轉酰基作用合成PS[10, 11]，與生物提取法相比，生物酶法反應條件溫和，無污染，產品安全等優點，目前PS合成主要使用生物酶法。

磷脂酶D( Phospholipase D, EC3,1.4.4, 縮寫為PLD)，是能夠催化磷酸酯鍵水解以及堿基交換反應能力的一類酶的總稱[12]。磷脂酶D具有廣泛的底物特異性，能夠合成各種稀有磷脂，例如磷脂酰甘油，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇以及一些人工稀有磷脂等[13-15]，它廣泛存在于動物，植物，及各種微生物如酵母、細菌中。早在1947年，Hanahan 和Chaikoff[16]等人在胡蘿卜中首次發現了PLD，隨后研究者又相繼在白菜、花生、棉子中發現了PLD的蹤跡。動物PLD主要分布在腦、肝臟等器官中，植物PLD主要分布在植物種子、根等組織中。微生物源的PLD由于其來源廣泛、水解及轉酯活性較高，因而是獲得PLD的最佳途徑。目前，已報道的產磷脂酶D的微生物種類繁多，主要有鏈霉菌(Streptomyces)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、大腸桿菌(Escherichia)、沙門氏桿菌(Salmonella)以及假單胞菌(Pseudomonas)等[17]。

本文主要對實驗室保藏菌種Acinetobacterradioresistensa2產生的PLD游離酶進行了固定化，實驗利用了5種大孔樹脂，通過對固定化載體，pH，固定化時間，載樣量以及緩沖液離子濃度的優化，確定了最佳固定化條件為：非極性陽離子交換樹脂H103是最佳固定化載體，固定時間80 min，加酶液量1.2 mL，pH 6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉的緩沖液濃度為10 mmol/L。最后在不同pH條件下，比較了游離PLD和固定化PLD的酶活回收率，在固定化之后，PLD的酶活回收率提高了三倍。

1材料與方法

1.1實驗材料

菌株：Acinetobacterradioresistensa2 由本實驗室篩選保藏。

1.2主要試劑

膽堿氧化酶，辣根過氧化物酶，氯化膽堿，Tris，EDTA，4-氨基安替吡啉，95%PC，曲拉通-100，乙醚。

培養基配方：

種子培養基(%)：蛋白胨 1，酵母粉0.5，NaCl 1，pH 7.4，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基(%)：蛋白胨 1， NaCl 0.3，MgSO4·7H2O 0.05，CaCl20.1，pH 6.5，蒸汽滅菌20 min冷卻后加入新鮮蛋黃2 mL。

1.3實驗方法

1.3.1微生物培養及發酵基質的準備

將菌種活化后接種于種子培養基中，以10%的接種量于發酵培養基中，28 ℃，180 r/min震蕩培養168 h。

1.3.2酶液制備

將發酵液離心(10 000 r/min，4 ℃，15 min)，收集離心液并以0.22 μm膜過濾，即為粗酶液。

1.3.3PLD酶活性測定方法

酶聯比色法是利用PLD水解PC產生膽堿，膽堿在膽堿氧化酶和過氧化物酶的作用下形成紅色顯色物質，在500 nm 處有最大吸收峰。由于膽堿氧化酶和過氧化物酶價格昂貴，在參考Imamura and Horiuti[18]方法下做了稍微的修改。PLD酶活性定義為在此反應條件下，每min水解產生1 μmol膽堿所需要的酶量為一個酶活單位。

1.3.4固定化載體的選擇及固定化條件優化

1.3.4.1固定化載體處理

固定化載體的預處理：分別取AB-8 、NKA-9、 H103 、D101、D301各0.1 g，分別置于6 mL親和層析柱中，依次加入5倍體積的0.5 mol/L HCl、5倍體積的0.5 mol/L NaOH、5倍體積的0.5 mol/L HCl進行洗脫，最后用pH 6.0 0.02 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(CPBS)進行5倍體積洗脫。各取1.3.2處理過的酶液1.0 mL與上述處理過的大孔樹脂混合，并分別加入pH 6.0 0.02 mol/L的CPBS緩沖液0.3 mL，置于搖床(4 ℃，120 r/min)吸附1 h，之后取出，將上清液放出并收集，吸附后的載體用上述CPBS緩沖溶液5倍體積洗滌，重復三次進行平行實驗。分別測定固定化酶的酶活力，計算酶活回收率并以之為指標，選擇具有較高酶活回收率的載體進行優化，并得出最佳固定化條件。

1.3.4.2固定化pH選擇

準確稱取固定化效果最佳的載體0.1g每份，按照1.3.4.1中所述方法進行預處理。之后分別用濃度20 mmol/L的 pH 5.0 NaAc-HAC、pH 6.0的PBS、pH 6.0 CPBS、pH 7.0 Tris-HCl、pH 8.0的Tris-HCl進行5倍體積洗脫。準確量取處理過的酶液1.0 mL與上述處理過的大孔樹脂進行混合，并分別對應加入上述緩沖液0.3 mL，置于搖床(4 ℃，120 r/min)吸附60 min后取出，將上清液放出，吸附后的載體再對應用上述緩沖溶液5倍體積洗滌，重復三次進行平行實驗，最后分別測定固定化酶的水解活力，然后計算酶活回收率，并以之為指標進行衡量。

1.3.4.3固定化條件優化

根據1.3.4.1、1.3.4.2結果選擇最優載體及最佳緩沖液pH，然后從固定時間、載體載量、緩沖液濃度三個方面對固定化條件進行優化。

(1) 固定化時間優化

準確稱取最優載體0.1 g，按照1.3.4.1中所述方法進行預處理。取1.3.2處理過的酶液1.0 mL與上述處理過的大孔樹脂混合，并分別加入pH 6.0的0.02 mol/L的CPBS緩沖液0.3 mL，置于搖床(4 ℃，120 r/min)上分別吸附30 min、60 min、70 min、80 min、90 min后取出，將上清液放出，吸附后的載體用上述CPBS緩沖溶液5倍體積洗滌，分別測定固定化酶的酶活力，重復三次進行平行實驗，然后計算酶回收率。

(2) 固定化酶液量優化

準確稱取最優載體 0.1 g，按照1.3.4.1中所述方法進行預處理。分別取1.3.2處理過的酶液0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、2.0 mL與上述處理過的大孔樹脂混合，并加入超純水補足2.0 mL，并分別加入pH 6.0的0.02 mol/L的CPBS緩沖液0.3 mL。置于搖床(4 ℃，120 r/min)上吸附60 min后取出，將上清液放出，吸附后的載體用上述CPBS緩沖溶液5倍體積洗滌，分別測定固定化酶的酶活力，重復三次進行平行實驗，計算酶回收率。

(3) 緩沖液濃度優化

準確稱取最優載體0.1 g，按照1.3.4.1中所述方法進行預處理。在用緩沖液洗脫的時候，分別用超純水、pH 6.0的1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L的CPBS緩沖液進行5倍體積洗脫。分別取1.3.2處理過的酶液1.0 mL與上述處理過的大孔樹脂混合之后再相應加入超純水、pH 6.0的1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L的CPBS緩沖液各0.3 mL，置于搖床(4 ℃，120 r/min)上吸附60 min后取出，將上清液放出，吸附后的載體用上述CPBS緩沖溶液5倍體積洗滌，測定固定化酶的酶活力，重復三次進行平行實驗。

2結果與討論

2.1固定化載體的選擇

固定化載體的理化性質對固定化效率及固定化酶催化能力有重要影響[23]。從圖1中可以發現在同等處理條件下的固定化效果，陽離子交換樹脂>吸附樹脂>陰離子交換樹脂。H103效果最好，其次是D101、H103 、D101均為非極性陽離子交換樹脂，固定化時加入pH 6.0的CPBS緩沖液，在該體系中陽離子交換樹脂的活性基團更易與PLD完成交換。由表1發現，H103與D101相比，平均孔徑較小，但比表面積較大，這使在相同固定條件下單位載體量的H103固定化效果更好。

表1　固定化載體性質

圖1　不同樹脂對PLD固定化效果的影響

2.2固定化pH選擇

磷脂酶D的理論等電點是9.5，因而在上述對應pH條件下，磷脂酶D均帶正電荷。圖2表明PLD固定化的最適pH及緩沖液為pH 6.0的CPBS緩沖液，這可能是因為CPBS緩沖液使酶分子和大孔樹脂的相互作用增強。

圖2　不同pH對PLD固定化效果的影響

2.3固定化條件優化

2.3.1固定化時間優化

圖3是固定化時間對PLD固定化的影響，表明隨著固定化時間的不斷延長，固定化酶的比活逐漸增加，當固定化時間是80 min時，酶活回收率最高，達到了97.99%。當時間繼續增至90 min時，酶活回收率降至71.69%。這可能是由于吸附時間過長而導致部分PLD失活，另一方面載體結合過多的酶時，其孔道被堵塞而導致酶蛋白分子相互屏蔽，與底物契合的酶數量減少[19]。因而固定化時間最優為80 min，這與文獻[20]報道的大孔樹脂固定假絲酵母脂肪酶的固定化酶活最佳時間為(60～90)min相吻合。

圖3　固定化時間對PLD固定化效果的影響

2.3.2載體載量優化

由圖4發現隨著酶液量的逐漸增加，固定化酶活回收率呈上升趨勢，當酶液量為1.2 mL時，固定化酶活和活力回收達到了最高(分別為82.13 U、97.77%)，然后隨著酶液量的進一步升高，固定化酶活和活力回收又分別降低至74.95 U、89.22%。單位質量的載體固定的酶量是一定的，所以隨著酶液量的增加，酶活力回收率反而下降。由此我們可以確定1.2 mL是固定化酶的最佳酶液量。

圖4　酶液量對固定化效果的影響

2.3.3CPBS緩沖液離子強度優化

緩沖液離子強度也是PLD固定化的重要影響因素之一。在圖5中，我們發現隨著離子強度的增加，固定化酶的比活及酶活回收率呈上升趨勢，在10 mmol/L，pH 6.0條件下固定化效果最好，酶活及酶活回收率分別達到了78.44 U、93.38%，這可能是因為離子強度過高，可能會產生某種電荷屏蔽作用，致使底物分子不能接近酶的活性中心，因而酶的催化效率會降低，而合適的離子濃度會促進酶與底物分子的結合。

圖5　CPBS離子強度對固定化效果的影響

2.4固定化和游離PLD比較

pH對固定化酶及游離酶活性的影響見圖6，以pH為7.0時的酶活為100%計算，由圖我們可發現二者的最適pH均為7.0，但是固定化酶在pH 5.0～8.0時活性都比較好，而游離酶只在pH 7.0～8.0范圍內保持較好的活力，這表明與游離酶相比，固定化酶受環境pH值的影響較小，適用的pH范圍較廣。在pH 6的條件下，固定化PLD的活力比游離PLD提高了三倍。

圖6　不同pH值下固定化酶及游離酶的相對酶活

3結論

以酶活回收率為主要指標，選擇H103作為固定化載體。并在此基礎上進行固定化條件優化，綜合固定化時間、酶液量、緩沖液濃度因素進行的單因素考察的結果，發現固定化最佳條件是固定時間為80 min，酶液量1.2 mL，pH 6.0濃度為10 mmol/L的CPBS緩沖液。與游離酶相比，固定化酶受環境pH值的影響較小，適用的pH范圍較廣。在pH 6的條件下，固定化PLD的活力比游離PLD提高了三倍。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.005

基金項目：山東省科技重大專項：海洋食品現代加工與產業鏈質量控制體系研究(2015ZDZX05003)；青島市市南區科技發展資金：蝦頭中功能物質的生物轉化技術及活性評價(2014-14-002-SW)；中央高校基本科研業務費專項基金：海洋生物酶工程平臺技術及應用(201564018)。

作者簡介：劉倩倩(1989～)，女，研究生。E-mail: 15253231129@163.com。 *通訊作者: 孫建安(1984～)，男，工學博士，講師，主要從事水產資源的酶催化轉化研究。E-mail:: sunjianan@ouc.edu.cn。

Immobilization of phospholipase D by macroporous resin

LIU Qian-qian, QIU Yong-qian, LIU Jiong-qin, SUN Jian-an , XUE Chang-hu, MAO Xiang-zhao

Food science and engineering, Ocean university of China, Shandong, Qingdao, 276000

AbstractPhospholipase D (PLD) generally defined as a kind of enzyme catalyzes PC to generate choline and PA. PLD transacylation is currently the best way for catalytic synthesis of phosphatidylserine. In this study, five kinds of macroporous resin were chosen to immobilize phospholipase D. The enzyme recovery activity was served as the main indexes, then the optimum carrier was confirmed and the immobilized conditions were optimized. The results showed that the nonpolar H103 was the best carrier and the optimum conditions for immobilized PLD were as follows: the amount of enzyme solution 1.2 mL, pH 6.0 of citric acid-sodium citrate buffer 10 mmol/L and immobilized for 80 minutes. Under the optimized conditions, the immobilized PLD displayed the highest activity, which was three times than that of the free PLD.

Key wordsphospholipase D; immobilization; macroporous resin