釀酒酵母生物合成胞磷膽堿的條件優化

易鳳炎，　陳燕妮，　邱蔚然，　周長林*

1. 中國藥科大學生命科學與技術學院， 江蘇 南京 210009；2. 南通秋之友生物科技有限公司, 江蘇 南通 226200

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釀酒酵母生物合成胞磷膽堿的條件優化

易鳳炎1,2，陳燕妮1，邱蔚然2，周長林1*

1. 中國藥科大學生命科學與技術學院， 江蘇 南京 210009；2. 南通秋之友生物科技有限公司, 江蘇 南通 226200

摘要：通過優化胞磷膽堿底物濃度的發酵條件，提高釀酒酵母發酵菌濃及胞磷膽堿轉化率。 分別以胞苷酸、磷酸膽堿、硫酸鎂和乙醇等底物和反應關聯物質誘導釀酒酵母，采用單因素變量實驗優化發酵條件。 優化后，釀酒酵母C401菌株搖瓶培養的菌濃為70 g/L，胞磷膽堿轉化率為53.3%，比誘導前提高了33.5%。30 L發酵中菌濃可達90.5 g/L，胞磷膽堿轉化率為59%。

關鍵詞：釀酒酵母； 胞磷膽堿； 底物誘導； 發酵

胞磷膽堿(CDPC)全稱胞苷-5′-二磷酸膽堿，屬于核酸類生化藥物。它是治療腦意識障礙的首選藥物[1]，對于腦外傷引起的腦昏迷、腦卒中后遺癥的功能恢復及老年癡呆等病癥都有獨特的療效，具有極好的應用前景。20世紀50年代，Kennedy博士等人[2]發現并確定胞磷膽堿鈉分子結構，稍后Rosseter等[3]闡明其功能。中國自20世紀70年代研究了利用酵母細胞生產胞磷膽堿的方法[4]，牛紅星[5]等利用固定化技術生產胞磷膽堿的方法，顧復昌[6]等利用啤酒酵母生物合成胞磷膽堿的方法，宋麗芳[7]等利用東方伊薩酵母生物合成胞磷膽堿的方法。

本實驗以釀酒酵母CGMCC2.603為出發菌種，分別利用胞苷酸、磷酸膽堿、硫酸鎂和乙醇等底物和反應相關物質誘導篩選出C401菌種，經優化培養基配方，30L發酵罐單因素變量實驗，提高了C401的菌濃，并通過發酵后處理提高了CDPC摩爾轉化率(以下簡稱轉化率)，實驗結果可應用于產業化生產。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌種

釀酒酵母CGMCC2.603，中國微生物菌種保藏中心。

1.1.2培養基

斜面培養基(%)：酵母浸膏0.5，蛋白胨1，葡萄糖1，瓊脂粉2，pH自然，0.8×105Pa滅菌20 min。

揺瓶和發酵培養基(%)：葡萄糖4，酵母浸膏4，(NH3)2HPO43，pH 5.0。搖瓶培養基0.8×105Pa滅菌20 min，發酵培養基90 ℃消毒20 min。

1.2實驗方法

1.2.1生物合成胞磷膽堿的釀酒酵母篩選方法

取斜面培養菌體2環接入裝有50 mL含有胞苷酸、磷酸膽堿、硫酸鎂和乙醇等誘導物的搖瓶培養基，培養24 h，將其轉接裝有400 mL含有胞苷酸、磷酸膽堿、硫酸鎂和乙醇的發酵培養基，培養24 h，經離心處理收集菌體，-40 ℃凍存25 d，測定釀酒酵母生物合成CDPC的轉化率。

1.2.2菌濃測定方法

用5 mL移液管移取4 mL待測菌液置入質量為m0的空EP管中，12 000 r/min離心4 min，棄去上清液，稱重即為m1，則菌濃為(m1-m0)×1 000/4 g/L。

1.2.3CDPC轉化率測定方法

在200 mL、pH 6.5含有30 mmol/L胞苷酸、21 mmol/L磷酸膽堿、25 mmol/L葡萄糖和27 mmol/L硫酸鎂等反應液中加入凍存菌體46 g，33 ℃，150 r/min反應2.5 h，補葡萄糖3.4 g，繼續反應，4.0 h取樣。12 000 r/min離心4 min，取上清液10 μL在瓊脂糖凝膠板點樣，電泳5 min，切取CDPC條帶加入0.01 mol/L鹽酸溶液5 mL，沸水浴5 min測定A280nm，利用CDPC瓊脂糖電泳測定的標準曲線計算轉化率[8]。

1.2.4菌種發酵方法

種子液以5%接種量接種于30 L發酵罐中培養，通氣量為0.55 m3/h，pH維持在4.0以上，分別改變攪拌槳組合和位置、裝液量、攪拌速度和接種種齡，發酵11 h，經抽濾處理收集菌體，-18 ℃凍存7 d ～10 d，測定CDPC的轉化率。

1.2.5殘糖測定方法

DNS法測定發酵液中殘糖濃度[9]。

2結果

2.1生物合成胞磷膽堿的釀酒酵母誘導物優化

在揺瓶培養基中加入不同濃度的胞苷酸進行底物誘導，由圖1(A)可知，當胞苷酸在低濃度時，隨著其濃度增加，誘導作用明顯提高，但其濃度達到10 mmol/L以上時，其誘導作用反而降低，這一現象與該反應在CMP一定濃度后存在底物抑制是相符的，故通過CMP底物誘導提高CDPC轉化率必須在較低濃度下才有效，以CMP 10 mmol/L為最佳濃度誘導時，其CDPC轉化率可從19.9%提高到53.3%。在揺瓶培養基中加入不同濃度的磷酸膽堿進行底物誘導，由圖1(B)可知，磷酸膽堿濃度10 mmol/L時誘導效果最佳，CDPC轉化率從19.9%提高到31.2%。在揺瓶培養基中加入不同濃度的硫酸鎂誘導，由圖1(C)可知，硫酸鎂濃度12g/L時，CDPC轉化率可從19.9%提高到23.7%。在揺瓶培養基加入不同濃度的乙醇誘導，由圖1(D)可知，隨著乙醇濃度增加，CDPC轉化率基本呈下降趨勢，說明乙醇有阻遏作用。

圖1　生物合成胞磷膽堿的釀酒酵母誘導物優化

2.2搖瓶培養基優化

在酵母浸膏1%～4%，糖蜜1%～5%，磷酸氫二銨0.1%～0.3%的條件下，按六西格瑪DOE(Design Of Experiment，實驗設計)表格設計實驗，用minitab 15軟件對菌濃響應分析，結果見表1。從表1可知，最佳培養基配方(%)：糖蜜5，酵母浸膏4，磷酸氫二銨0.3，pH 5.0。若用葡萄糖代替糖蜜，結果如表2，培養基配方(%)：葡萄糖4，酵母浸膏4，磷酸氫二銨0.3，pH 5.0。在培養基中加入不同量的生物素，結果如圖2。此時生物素的添加，對于菌濃無明顯提升，因此在培養基中不需添加生物素。經上述搖瓶培養基優化，C401菌種搖瓶培養菌濃為70 g/L，發酵培養基也沿用此配方。

表1　培養基優化的DOE實驗表

表2　用葡萄糖代替糖蜜的培養基表

圖2　生物素量對菌濃的影響

2.3搖瓶培養時間對菌濃和CDPC轉化率的影響

將50 mL揺瓶菌液接種到400 mL揺瓶培養基中，28 ℃、150 r/min培養，每4 h取樣測定菌濃，培養48 h，結果如圖3(A)，培養8 h進入對數生長期，24 h進入穩定期，菌濃為70 g/L，培養至48 h菌濃為81 g/L。分別取不同培養時間菌體測定CDPC轉化率，結果如圖3(B)，當培養時間較短時，隨著培養時間延長，CDPC轉化率明顯提高，但其時間達到24 h以上時，CDPC轉化率反而降低，培養24 h的菌體CDPC轉化率最高，可達53%。

圖3　培養時間對菌濃和CDPC轉化率的影響

2.430 L罐的發酵研究

2.4.1裝液量、攪拌速度、攪拌槳不同間距對氣液分散狀態的影響

在30 L罐(示意圖如圖4)上配置三層攪拌槳，其中上層槳和底槳為六平葉Rushton渦輪徑向流槳，中層槳為四斜葉開啟渦輪軸向流槳，三層槳槳徑均為D=0.4T，底槳離底距離C1，上層槳離液面距離△H，中層槳離底槳距離C2。攪拌槳不同組合間距如表4所示，在攪拌槳間距為組合1時，以清水為工作介質，攪拌轉速在300 r/min以上，常溫下操作，裝液量18 L～20 L時呈載氣狀態，裝液量不在此范圍呈氣泛狀態。在攪拌槳間距為組合2時，以清水為工作介質，攪拌轉速在250 r/min以上，常溫下操作，裝液量17 L～21 L時呈載氣狀態。通過上述實驗，組合2比組合1更好。

圖4　30 L罐示意圖

表3　攪拌槳不同間距組合方式

2.4.2發酵研究

在攪拌槳間距為組合2，接種量為5%的條件下，研究了不同攪拌轉速、裝液量和接種種齡對菌濃的影響。攪拌轉速如圖5(A)所示，400 r/min 的溶氧(DO)較好，菌濃最高達36 g/L。裝液量如圖5(B)所示，裝液量20 L的DO較好，在2.4.1所述的17 L～21 L載氣狀態范圍內，與15 L氣泛狀態相比，18 L、20 L裝液量發酵狀態的DO均高于15 L裝液量發酵狀態的DO。在17 L～21 L載氣狀態時，18 L要優于20 L，此時菌濃可達40 g/L。接種種齡如圖5(C)所示，接種種齡為26 h較好，此時比生長速率大，菌濃可達41 g/L。

由2.4節實驗確定30 L罐發酵最優條件為：在攪拌槳間距為組合2，接種量為5%的條件下，攪拌轉速為400 r/min，裝液量為18 L，接種種齡為26 h。

2.530 L罐補糖發酵

在2.4最優發酵條件下雖參照文獻[10]進行葡萄糖流加實驗，結果如圖6所示，方案1，起始葡萄糖濃度為20 g/L，殘糖濃度低于10 g/L時流加葡萄糖，菌濃可達42 g/L，與未補糖發酵比較菌濃無明顯提高。方案2，起始葡萄糖濃度減為10 g/L，殘糖濃度低于8 g/L時流加葡萄糖，菌濃可達68 g/L。方案3，起始葡萄糖濃度為10 g/L，殘糖濃度低于5 g/L時流加葡萄糖，菌濃可達90 g/L。由上述實驗可知，起始葡萄糖10 g/L，殘糖濃度低于5 g/L時補糖效果最好。

2.6發酵后處理

據文獻報道[11]無氧狀態下酶系比有氧狀態下酶系更利于生物合成CDPC，因此發酵后抽濾收集菌體，分別用2%葡萄糖溶液低溫浸泡不同時間。由圖7可知，隨著菌體浸泡時間從0 d增加到4 d，CDPC轉化率先增后減，其中菌體浸泡2 d時，CDPC轉化率最高為59%，比未浸泡組提高了6%。

圖5　發酵研究圖

3討論

經10 mmol/L胞苷酸誘導篩選菌種C104，在葡萄糖4%、酵母浸膏4%、磷酸氫二銨0.3%、pH 5.0條件下，C104搖瓶菌濃可達70 g/L，底物轉化CDPC的轉化率為53.3%，比出發株提高了33.5%。在接種種齡26 h，裝液量18 L，攪拌速度400 r/min，三層攪拌槳間距0.55 T，下層攪拌槳到攪拌釜底距離0.36 T的條件下，30 L發酵液呈載氣狀態，流加葡萄糖發酵，菌濃可達90.5 g/L，發酵后將菌體用2%葡萄糖溶液低溫浸泡2 d，CDPC轉化率為59%。以上實驗結果已可應用于CDPC產業化生產，下階段任務將進一步優化CDPC反應條件，進一步提高其轉化率。

圖6　30 L補糖發酵進程曲線

圖7　30 L發酵后處理

參考文獻

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[9]陳長華. 發酵工程實驗[M]. 北京: 高等教育出版社, 2009: 187-188.

[10]王穎, 何寧, 李清彪等. 釀酒酵母S.cerevisiae高密度培養條件優化研究[J]. 工業微生物, 2007,37(1): 34-38.

[11]邱蔚然, 丁慶豹. 核酸類產品的生物合成[M].上海: 華東理工大學出版社, 2006: 80-82.

doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.007

基金項目：江蘇省科技成果轉化專項資金資助項目(NO.BA2012090)。

作者簡介：易鳳炎(1992～)，女，碩士在讀生。E-mail：yifengyan@yeah.net。 E-mail:cl_zhou@cpu.edu.cn。

*通訊作者：周長林(1964～)，男，教授，博士生導師，研究領域為微生物代謝調控和藥物生物合成。電話：025-83271323，

Optimization of fermentation conditions for citicoline biosynthesis bySaccharomycescerevisiae

YI Feng-yan1,2, CHEN Yan-ni1, QIU Wei-ran2, ZHOU Chang-lin1

1. School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China;2. Nantong QZU Bioscience & Biotechnology Co. Ltd, Nantong 226200, China

AbstractIn order to increase fermentative cell concentration of Saccharemyces cerevisiae and to improve citicoline conversion rate, the substrates and fermentation conditions were optimized. Saccharomyces cerevisiae cells was induced by substrates and related reactants such as cylidylicacid(CMP), choline phosphate, magnesium sulfate and ethanol, respectively and the fermentation conditions were optimized by single factor variable experimental tests. The results showed that after optimization, the cell concentration of Saccharomyces cerevisiae C401 reached 70 g/L in the shake flask cultures, which was 33.5% higher than before. In 30 L fermentation test, the cell concentration was up to 90.5 g/L and the citicoline conversion rate reached 59%, respectively.

Key wordsSaccharomyces cerevisiae; citicoline; substrate induction; fermentation