多重PCR-DHPLC快速檢測食品中產志賀毒素大腸桿菌

晚觀生，　劉曉玉，　鄭秋月，　徐君怡，　曹際娟*

1.大連工業(yè)大學，遼寧大連 116034；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連 116001

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多重PCR-DHPLC快速檢測食品中產志賀毒素大腸桿菌

晚觀生1，劉曉玉1，鄭秋月2，徐君怡2，曹際娟2*

1.大連工業(yè)大學，遼寧大連 116034；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連 116001

摘要：應用多重PCR(motiplex PCR)結合變性高效液相色譜技術(denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)建立了快速檢測食品中產志賀毒素大腸桿菌O111和O157的方法。以基因wzxO111、rfbEO157為靶基因，建立多重PCR-DHPLC方法，進行特異性和靈敏度測試，同時進行RT-PCR檢測比較靈敏度。該方法具有良好特異性，可以一次PCR擴增同時檢測O111、O157；靈敏度達到25 CFU/mL。129份牛肉樣品中檢出1例O111，3例O157陽性；74份雞肉樣品中檢測出O111、O157陽性各1例，67份蔬菜樣品中未檢測到O111、O157。本文建立O111、O157多重PCR-DHPLC檢測方法，操作簡便，特異性強，適用于產志賀毒素大腸桿菌篩選檢測。

關鍵詞：多聚酶鏈式反應； 變性高效液相色譜； 檢測； 產志賀毒素大腸桿菌

產志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli,STEC)是一類危害嚴重的食源性病原菌，能引起人類嚴重疾病，如出血性結腸炎(HC)、溶血性尿毒癥(HUS)等，甚至引起死亡,已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[1-2]。根據血清型的不同可將STEC分為O157STEC和非O157STEC。除了致病型O157型STEC外，非O157型STEC中O111菌株近年來成為高致病力菌株，對人類的健康也存在嚴重威脅。人類通過食用被污染的食物和飲水而感染此類病原菌[3-4]。

目前，產志賀毒素大腸桿菌鑒定仍主要依靠傳統培養(yǎng)鑒定和血清學方法[5-6]。由于產STEC種屬之間或與其他大腸桿菌生化反應極為相似，難于分離，不同的“O”血清型之間還存在交叉反應，導致菌株無法準確鑒定。而且進口血清價格昂貴，國產血清效價不穩(wěn)定，傳統培養(yǎng)鑒定方法檢測周期長，已無法滿足當今食品安全快速發(fā)展的需求[7]。DHPLC方法可以穩(wěn)定準確從種屬菌株水平鑒別微生物, 彌補傳統生化鑒定方法的缺陷。本文通過非變性條件下，優(yōu)化多重PCR反應條件及DHPLC洗脫梯度，建立了多重PCR-DHPLC快速檢測O111、O157的方法。具有快速、準確度高、重復性好及敏感性高等特點[11-14]。

1材料

1.1菌種

產志賀毒素大腸桿菌O157購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)；產志賀毒素大腸桿菌購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)，其他菌株分別購自ATCC和中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)，或為本實驗室或其他檢驗檢疫局實驗室分離鑒定獲得的分離株。

1.2主要培養(yǎng)基

改良蛋白胨大豆肉湯(TSB+1.5 g/L膽鹽三號mTSB)；普通營養(yǎng)肉湯；營養(yǎng)瓊脂斜面；科瑪嘉O157顯色培養(yǎng)基；3M大腸桿菌/大腸菌群快速檢測紙片；O111特異診斷血清(寧波天潤生物藥業(yè)有限公司)；O157特異診斷血清(丹麥國立血清研究所)。

1.3主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒(TakaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit)，Multiplex PCR Assay Kit Ver.2等試劑購自寶生物(大連)工程有限公司。三乙胺乙酰鹽(TEAA，色譜純)購自Transgenomic公司；乙腈(色譜純)購自Fisher公司；DHPLC緩沖液：緩沖溶液A為50 mL TEAA、250 μL乙腈定容至1 000 mL；緩沖溶液B為50 mL TEAA、250 mL乙腈定容至1 000 mL；緩沖溶液D為75%乙腈[15]。

表1　試驗菌種及其編號

1.4引物和探針

實時熒光PCR特異引物序列及探針由寶生物(大連)工程有限公司設計合成， 見表2。多重PCR中wzxO111、rfbEO157引物分別引用文獻16、17，由寶生物(大連)工程有限公司合成(見表3)。

表2　熒光定量PCR引物及探針信息

注：(—)表示無需標記

1.5儀器設備

普通PCR 儀PE24000(PerkinElmer公司，美國)；變性高效液相色譜儀NAV-99-4500(Transgenomic 公司，美國)； Vii7數字熒光定量PCR(美國ABI儀器公司)； VITEK2-30全自動微生物鑒定儀(法國生物梅里埃公司)。

表3　普通PCR引物信息

2試驗方法

2.1DNA模板提取

取表1中20株所試菌株進行普通肉湯增菌培養(yǎng)。提取細菌基因組DNA, -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2RT-PCR反應體系及擴增條件

經過多次試驗比對建立最適反應體系:PremixExTaq(Probe qPCR)(2×)12.5 μL；ROX Reference Dye II(50×)0.5 μL；上下游引物(10 μM)各0.5 μL；TaqMan Probe 1 μL； DNA模板2 μL；水8 μL，總體系25 μL。擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s；56 ℃退火(延伸)34 s；進行40個循環(huán)。

2.3多重PCR反應體系及擴增條件

多重PCR反應體系：2×Multiplex PCR Buffer(Mg2+, dNTP plus)25 μL；Multiplex PCR Enzyme Mix 0.25 μL；各引物對1 μL；模板DNA 2 μL；加水補足50 μL體系。擴增反應條件：94 ℃ 60 s；94 ℃變性30 s；57 ℃退火45 s；72 ℃延伸30 s，進行35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。4 ℃保存反應產物。

2.4DHPLC分析條件

色譜柱:PS-DVB& C18 DNASep色譜柱(4.6 mm×50 mm, 粒度3 μm)；柱溫：50 ℃。流動相：0 min，55 % 緩沖溶液A，45%緩沖溶液B；0.5 min，50.2%緩沖溶液A，49.8%緩沖溶液B；3.6 min，41.8%緩沖溶液A，58.2%緩沖溶液B；6.8 min，38.2%緩沖溶液A，61.8% 緩沖溶液B；9.9 min，36.3%緩沖溶液A，63.7%緩沖溶液B；13 min，35%緩沖溶液A，65%緩沖溶液B；流速：0.9 mL/min。上樣量：PCR產物5 μL[18-19]。

2.5特異性試驗

取表1中20株細菌建立DNA模板庫, 進行RT-PCR特異性檢測，同時采用2.4中DHPLC方法進行驗證。

2.6靈敏度試驗

各取1 mL標準菌株O111、O157增菌液，梯度稀釋，取10-6、10-7兩個梯度1 mL進行平板涂布，每個梯度兩個平行，采用GB4789.2-2010進行菌落計數[20]。分別采用RT-PCR和多重PCR-DHPLC方法進行靈敏度檢測。

2.7實際樣品檢測

最后隨機抽取送檢至遼寧出入境檢驗檢疫局實驗室的129份冷凍牛肉、74份雞肉、67份蔬菜樣品，采用本文建立的RT-PCR和多重PCR-DHPLC方法進行實際樣品檢測。

3結果分析

3.1特異性試驗

RT-PCR特異性試驗中只有O111、O157目標菌株出現特異性陽性擴增如圖1、圖2，其他參考菌株檢測結果均為陰性。多重PCR-DHPLC檢測結果如圖3所示，結果表明O111具有特異性吸收峰，O157特異性吸收峰明顯，其他對照菌株均未出現明顯的吸收峰，表明本文的引物特異性良好。

圖1　O111 RT-PCR特異性擴增結果

圖2　O157 RT-PCR特異性擴增結果

A. O111(ATCC 43887)特異吸收峰； B. O157(CICC 21530)特異吸收峰

C. O111(ATCC 43887)特異吸收峰；

D. O157(CICC 21530)特異吸收峰

3.2靈敏度試驗

結果如表4所示，結果表明本文建立的多重PCR-DHPLC方法與RT-PCR方法，最低檢測限均達到2.5×101CFU/mL。

表4　mPCR-DHPLC與RT-PCR靈敏度檢測結果

+：代表陽性-：代表陰性

3.3實際樣品檢測

本文建立的多重PCR-DHPLC方法與RT-PCR方法檢測129份樣品，牛肉樣品中檢出1份O111陽性、3份O157陽性；74份雞肉中檢出1份O157陽性，未檢測到O111，67份蔬菜中未檢測到O111及O157如表5。

4討論

本文建立了多重PCR結合DHPLC準確快速檢測食品中產志賀毒素大腸桿菌O111、O157。通過多次試驗發(fā)現，影響多重PCR結果主要是PCR反應的退火溫度及延伸時間，同時引物對的濃度也直接影響方法的特異性和靈敏度。通過與RT-PCR靈敏度比較發(fā)現，該方法不僅保證與RT-PCR具有相同的靈敏度，還可以實現高通量檢測，而且省去了探針設計的過程，避免了由探針問題造成假陽性或假陰性的結果，操作過程簡單，自動化可更好的適用于食品檢測。本文從實際樣品中分離出來的產志賀毒素大腸桿菌陽性菌株，通過血清型鑒定，均證實為產志賀毒素大腸桿菌，證明多重PCR-DHPLC檢測方法具有廣泛的適用性。

表5　mPCR-DHPLC與RT-PCR檢測結果比較

在食品中產志賀毒素大腸桿菌常為低污染量存在，常規(guī)直接分離法存在著鑒別力差、抑制雜菌能力弱、耗時長、工作量大等缺點 影響了該菌的檢出率，達不到相關食品檢驗監(jiān)管部門檢測要求。開展不同食品基質中目標菌分離方法研究，采用免疫磁珠技術富集分離食品中低污染量產志賀毒素大腸桿菌，是本文下一步研究方向。本文將在現有成果基礎上進行樣品中目標菌富集方法研究，解決不同基質對菌體活性干擾、降解因素難題，開展納米磁珠高效富集分離低污染量產志賀毒素大腸桿菌的方法，解決目標菌檢出率低的難題。建立納米磁珠高效富集結合多重PCR-DHPLC檢測方法，進一步提高食品中產志賀毒素大腸桿菌的檢測效率。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.008

基金項目：質檢總局課題(2015IK168)；質檢公益性行業(yè)科研專項(201210043)。

作者簡介：晚觀生(1990～)，男，碩士研究生，主要研究方向為食品安全與檢驗檢疫。E-mail:wanguansheng@126.com。 *通訊作者：曹際娟，女，博士，研究員，主要研究方向為食品安全與檢驗檢疫。E-mail:caojijuanlnciq@163.com。

Rapid detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli by multiplex PCR and DHPLC

WAN Guan-sheng1, LIU Xiao-yu1, ZHENG Qiu-yue2, XU Jun-yi2, CAO Ji-juan2

1. Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of China, Dalian 1160001, China

AbstractThe method of multiplex PCR combined with denaturing high-performance liquid chromatography was established for rapid detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli O111 and O157 in food. The multiplex PCR assay for detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli O111 and O157 was developed using primers with specifically amplifing segments of wzxO111 and rfbEO157 genes. The method was carried out for specificity and sensitivity testing and its sensitivity was compared with RT-PCR method at the same time. Results indicated that the multiplex PCR-DHPLC had good specificity; a PCR amplification could detect both O111 and O157 simultaneously. The detection limit of the mPCR was 25 CFU/mL for sensitivity. One of O111 and three of O157 were detected in 129 beef meat samples. In 74 chicken meat samples contained one of O111 and one of O157. Shiga toxin-producing Escherichia coli O111 and O157 were not detected in 67 vegetables. As a result, the multiplex PCR-DHPLC detection method for O111, O157 was simple, specific and suitable for Shiga toxin Escherichia coli screening test.

Key wordsmultiplex polymerase chain reaction (mPCR); denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC); detection; Shiga toxin-producing Escherichia coli