加味四物湯動(dòng)員心肌梗死小鼠骨髓干細(xì)胞改善心室重構(gòu)*

魏　英，王鈺瑩，余麗梅△，方　寧，姚觀平

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563003；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，湖北十堰 442000 )

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加味四物湯動(dòng)員心肌梗死小鼠骨髓干細(xì)胞改善心室重構(gòu)*

魏英1,2，王鈺瑩1，余麗梅1△，方寧1，姚觀平1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563003；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，湖北十堰 442000 )

[摘要]目的觀察加味四物湯 (mSWT) 對(duì)心肌梗死 (MI)小鼠骨髓干細(xì)胞動(dòng)員的影響，探討mSWT改善心室重構(gòu)的機(jī)制。方法結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支建立小鼠MI模型，灌胃給予mSWT，小鼠被分為4組：假手術(shù)對(duì)照組，MI模型組，mSWT低劑量(5 g·kg-1·d-1)組和mSWT高劑量(10 g·kg-1·d-1)組，每組10只。行心肌組織病理學(xué)檢查，流式細(xì)胞術(shù)分析造血干細(xì)胞 (HSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs)占骨髓和外周血細(xì)胞的百分比。結(jié)果 mSWT 高、低劑量組治療14 d后，較MI模型組小鼠左心室壁較厚，MI面積減小，梗死區(qū)域可見(jiàn)大量島狀分布的心肌細(xì)胞，心室重構(gòu)明顯改善。且小鼠骨髓和外周血中HSCs及MSCs細(xì)胞百分比明顯增加(P<0.05)。結(jié)論mSWT可能通過(guò)促進(jìn)MI小鼠骨髓HSCs和MSCs的增殖和向外周動(dòng)員，參與改善MI后的心室重構(gòu)。

[關(guān)鍵詞]心肌梗死；骨髓干細(xì)胞；加味四物湯；心室重構(gòu)

心肌梗死(myocardial infarction,MI)發(fā)生后，一定數(shù)量的骨髓干細(xì)胞能夠遷移到受損的心肌組織中，生成心肌細(xì)胞和新生血管[1]；但因干細(xì)胞數(shù)量有限，難以形成足夠的心肌組織和新生血管，取而代之形成瘢痕，導(dǎo)致心室重構(gòu)。較多的研究表明，采用粒細(xì)胞集落刺激因子等造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)動(dòng)員劑治療MI，取得了一定的療效[2]。加味四物湯 (modified Siwutang,mSWT)是根據(jù)四物湯改劑而成，由當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地加人參等中藥制成。四物湯是臨床常用的補(bǔ)血方，是調(diào)節(jié)血管活性的物質(zhì)，用于治療血虛證等[3]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，四物湯及其組方中的多味中藥可促進(jìn)血虛癥小鼠骨髓細(xì)胞增殖，增加血液有形成分，加強(qiáng)心臟收縮性能，提高心臟泵血功能[4-5]。本文主要探究了mSWT通過(guò)影響MI小鼠骨髓和外周血HSCs和間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells,MSCs) 而改善心室重構(gòu)的重要藥理學(xué)作用。

1材料與方法

1.1材料mSWT的組方生藥材購(gòu)于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，由遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科楊建文副主任藥師鑒定。生藥材按比例配制，加入水浸泡后，加熱回流提取，減壓濃縮成含生藥量1 g/mL 的 mSWT濃縮液，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)配制成所需濃度。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與處理雄性昆明種 (KM)小鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量25～30 g，40只。由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 (許可證號(hào)：SCXK20080001)。小鼠被分為4組，每組10只，假手術(shù)組(對(duì)照組)，MI模型組 (模型組)，mSWT低劑量組(mSWT-L組,5 g·kg-1·d-1)和mSWT高劑量組 (mSWT-H組,10 g·kg-1·d-1)。采用改良的氣管插管法進(jìn)行氣管插管后[6]，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支制備MI模型。術(shù)后第1天開(kāi)始灌胃給藥，對(duì)照組和模型組給予同等體積的蒸餾水，連續(xù)14 d。

1.2.2心臟組織病理學(xué)檢查開(kāi)胸后，取小鼠心臟，在結(jié)扎點(diǎn)以下，留取近心尖部分， 4%多聚甲醛固定、脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析末次給藥2 h后麻醉小鼠，摘除眼球取外周血(PB)于EDTA 2K+抗凝管；另取雙側(cè)股骨，0.5 mL生理鹽水反復(fù)沖洗，收集骨髓腔細(xì)胞。骨髓(BM)和外周血細(xì)胞加入PE標(biāo)記的抗小鼠CD3、CD4、CD8a、T119、Gr1、CD11b、CD166和CD105單抗，抗小鼠CD44-FITC、Sca-1-Percp抗體及其同型對(duì)照孵育、裂解紅細(xì)胞和洗滌、固定等，BD FACS Caliber流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析HSCs和MSCs百分比。

2結(jié)果

2.1mSWT改善心肌組織病理學(xué)變化小鼠心臟組織HE染色，鏡下見(jiàn)對(duì)照組左心室壁較厚，心肌排列整齊，染色均勻，無(wú)梗死灶和纖維化組織。模型組左心室壁明顯變薄，尤其心尖處明顯，梗死區(qū)少見(jiàn)心肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞溶解壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維素樣變明顯。與模型組比較，mSWT-L和mSWT-H組，左心室壁較厚，MI面積明顯較小，梗死區(qū)可見(jiàn)大量島狀分布的心肌細(xì)胞，心室重構(gòu)改善明顯，見(jiàn)圖1。

A:小鼠左心室組織HE染色(×50)；B：小鼠左心室組織HE染色(×200)。

圖1MI小鼠左心室組織病理學(xué)的變化

A：CD117+Sca-1+,所有細(xì)胞均為CD3-、CD4-、CD8a-、Tr199-、Gr-、CD11b-；B：HSCs在BM中的表達(dá)；C：HSCs在PB中的表達(dá)。*：P<0.05,**：P<0.01，與模型組比較。

圖2mSWT上調(diào)MI小鼠BM和PB中HSCs百分率

A：CD166+CD155+CD44+,所有細(xì)胞均為Sca-1-；B：MSCs在BM中的表達(dá)；C：MSCs在PB中的表達(dá)。*：P<0.01,與對(duì)照組比較;**：P<0.01，與模型組比較。

圖3mSWT上調(diào)MI小鼠BM和PB中MSCs百分率

2.2mSWT上調(diào)MI小鼠BM和PB中HSCs和MSCs百分率小鼠HSCs表達(dá)Lin-Sca-1+c-kit+為特征，MSCs缺乏特異性標(biāo)志，可以CD166+CD155+CDCD44+Sca-1-等聯(lián)合標(biāo)記為其表面標(biāo)志。MI小鼠給予mSWT治療14 d，與對(duì)照組相比，模型組BM及PB細(xì)胞中HSCs細(xì)胞比例有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)；與模型組相比，mSWT-H組BM和PB中HSCs細(xì)胞比例均顯著增加 (P<0.05)，見(jiàn)圖2。同時(shí)，與對(duì)照組相比，模型組BM與PB中MSCs比例也顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，mSWT-L組PB中MSCs比例顯著增加 (P<0.01)，而mSWT-H組BM與PB中MSCs比例均顯著增加 (P<0.01)，見(jiàn)圖3。

3討論

生理狀態(tài)下，BM中HSCs和MSCs數(shù)量遠(yuǎn)高于PB循環(huán)中數(shù)量，然而心肌缺血可刺激BM釋放HSCs等進(jìn)入外周血，并可歸巢到缺血梗死區(qū)[7]，一定限度地參與損傷心肌組織的修復(fù)，但遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足需要。為此，研究者們不斷嘗試，使用干細(xì)胞動(dòng)員劑粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、干細(xì)胞因子 (SCF)等藥物干預(yù)，增加和動(dòng)員BM干細(xì)胞，達(dá)到有效的心肌損傷修復(fù)。然而，有研究者發(fā)現(xiàn)，在不恰當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)使用G-CSF后，可加重MI的炎性反應(yīng)和臨床癥狀，也可引起血管成形術(shù)后再狹窄發(fā)生率的增高[8]。因而積極尋找更優(yōu)的MI治療干細(xì)胞動(dòng)員劑具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)mSWT治療后，MI小鼠心室壁明顯較模型組厚，MI面積縮小，梗死區(qū)存在大量心肌細(xì)胞，纖維素樣變明顯較少，表明mSWT可明顯改善MI小鼠的心室重構(gòu)。業(yè)已證明，MI后有少量BM干細(xì)胞動(dòng)員到外周，并遷移、定植到MI區(qū)域[9]。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，mSWT-H治療組小鼠BM和PB中HSCs百分率明顯高于模型組，且mSWT 2個(gè)劑量組小鼠BM和PB中MSCs均明顯高于模型組，提示BM中HSCs和MSCs增殖顯著提高，并明顯增加BM干細(xì)胞動(dòng)員，向PB或梗死心肌區(qū)域的遷移。大量研究認(rèn)為，HSCs和MSCs可通過(guò)多種機(jī)制，促進(jìn)心肌損傷的修復(fù)，改善梗死心肌組織的病理結(jié)構(gòu)，明顯提高心臟功能[9]。以往的研究也報(bào)道四物湯可治療實(shí)驗(yàn)性急性溶血性貧血，不同程度地增加紅細(xì)胞、血紅蛋白和網(wǎng)織紅細(xì)胞等血液有形成[10]；能促進(jìn)CO60γ照射和注射環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的BM抑制小鼠血象改善，提高HSCs數(shù)量及粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成單位和紅系集落形成單位生成，且能促進(jìn)BM細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)BM細(xì)胞增殖，并抑制BM細(xì)胞凋亡，改善BM造血微環(huán)境等[11-12]。mSWT中增加的中藥人參，富含人參皂苷Rg1，也能促進(jìn)臍帶血HSCs增殖，增加環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠BM和PB中HSCs、MSCs等數(shù)量，明顯改善骨髓抑制小鼠造血功能[13]。由此可見(jiàn)，mSWT 通過(guò)促進(jìn)BM干細(xì)胞的增殖或動(dòng)員，提高PB中干細(xì)胞比例，并可移行到MI梗死區(qū)，可能通過(guò)血管新生、分化為心肌細(xì)胞或發(fā)揮旁分泌作用等作用，參與MI的修復(fù)。

總之，積極探索mSWT等骨髓干細(xì)胞動(dòng)員劑，促進(jìn)MI后心臟功能恢復(fù)，改善MI病理組織學(xué)，改善心室重構(gòu)，是值得進(jìn)一步探索的MI治療新策略。

參考文獻(xiàn)

[1]Moccetti T,Leri A,Goichberg P,et al.A Novel Class of Human Cardiac Stem Cells [J].Cardiol Rev,2015,23(4):189-200.

[2]Kang HJ,Kim MK,Lee HY,et al.Five-year results of intracoronary infusion of the mobilized peripheral blood stem cells by granulocyte colony-stimulating factor in patients with myocardial infarction[J].Eur Heart J,2012,33(24):3062-3069.

[3]毛秉豫.加味四物湯降壓作用及對(duì)左心室肥厚影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].南陽(yáng)理工學(xué)院學(xué)報(bào),2009,1(6):88-92.

[4]朱敏,段金廒,唐于平,等.采用化學(xué)藥物聯(lián)合致小鼠血虛模型評(píng)價(jià)四物湯及其配伍組成的作用特點(diǎn)[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(18):2544-2547.

[5]李鐵軍,鄭欽岳.四物湯對(duì)正常大鼠心功能的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1995,16(3):241-242.

[6]魏英,余麗梅,潘麗,等.改良?xì)夤懿骞芊ㄔ谛∈笮募」Ｋ滥Ｐ椭苽渲械膽?yīng)用[J].中國(guó)運(yùn)用生理學(xué)雜志,2011,27(3):380-383.

[7]Wojakowski W,Kucia M,Zuba-Surma E,et al.Very small embryonic-like stem cells in cardiovascular repair [J].Pharmacol Ther,2011,129(1):21-28.

[8]Ohashi K,Kiura K.Appropriate use of granulocyte-colony stimulating factor[J].Nihon Rinsho,2015,73 Suppl 2:S336-340.

[9]Huber BC,Beetz NL,Laskowski A,et al.Attenuation of cardiac hypertrophy by G-CSF is associated with enhanced migration of bone marrow-derived cells[J].J Cell Mol Med,2015,19(5):1033-1041.

[10]龔文君，沃興德.四物湯對(duì)乙酰苯肼致溶血性貧血模型大鼠的治療作用[J].浙江中醫(yī)雜志,2009,44(9):640-641.

[11]陳志偉，祝彼得，許惠玉，等.四物湯配方顆粒與四物湯對(duì)骨髓抑制小鼠造血損傷恢復(fù)作用的比較研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2007,34(16):3058-3062.

[12]肖成榮，馬增春，梁乾德，等.四物湯不同部位對(duì)輻射小鼠外周血象的影響 [J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(4):306-309.

[13]Xu SF,Yu LM,Fan ZH,Wei Y,et al.Improvement of ginsenoside Rg1 on hematopoietic function in cyclophosphamide-induced myelosuppression mice [J].Eur J Pharmacol,2012,695(1/2/3):7-12.

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.002

*基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃(黔科合S字[2007]1029)；遵醫(yī)(2006)034博士啟動(dòng)基金。

作者簡(jiǎn)介:魏英(1980-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心血管藥理研究。△通訊作者， E-mail：ylm720@sina.com。

[中圖分類(lèi)號(hào)]R956.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)15-2032-04

(收稿日期：2015-11-14修回日期：2016-01-18)

Modified Siwu decoction for mobilizing bone marrow stem cell to improve ventricular remodeling in mice myocardial infarction*

Wei Ying1,2,Wang Yuying1,Yu Limei1△,Fang Ning1,Yao Guanping1

(1.KeyLaboratoryofCellEngineeringofGuizhouProvince,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China;2.DepartmentofMedicineExperimentCenter,AffiliatedDongfengHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan,Hubei442000,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of modified Siwu decotion(mSWT) on bone marrow stem cell mobilization，and to investigate the mechanisms of mSWT for improving ventricular remodeling.MethodsThe mouse myocardial infarction (MI) model was set up by ligating the anterior descending coronary artery.Mice were intragastrically administrated with mSWT.The mice were randomly divided into 4 groups:sham operation control group,MI model group,mSWT low dose(5 g·kg-1·d-1) group and mSWT high dose(10 g·kg-1·d-1) group,10 cases in each group.The myocardial tissue pathological examination was performed.The proportion of hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) to bone marrow and peripheral blood cells were analyzed by flow cytometry.ResultsAfter 14 d treatment by 5,10 g·kg-1·d-1mSWT,the left ventricular wall was thickened compared with the model MI mice,the myocardial infarction area was decreased,large number of survival mycardial cells as island type distribution could be found in the infarction area,and the ventricular remodeling was significantly improved,moreover the percentages of HSCs and MSCs cells in bone marrow and peripheral blood were significantly increased (P<0.05).ConclusionmSWT might promote MI mouse bone marrow HSCs and MSCs proliferation and mobilization to periphery to participate in the ventricular modeling after improving the myocardial infarction.

[Key words]myocardial infarction;bone marrow stem cell;modified Siwu decoction;ventricular remodeling