Sirt1調控軟骨細胞自噬在骨關節炎中作用及機制

李春亮，李釗偉，秦　鳳

(青海大學附屬醫院創傷骨科，西寧 810000)

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Sirt1調控軟骨細胞自噬在骨關節炎中作用及機制

李春亮，李釗偉△，秦鳳

(青海大學附屬醫院創傷骨科，西寧 810000)

[摘要]目的探討沉默信息調節因子1(Sirt1)調控軟骨細胞自噬在骨關節炎(OA)中作用及機制的研究。方法免疫組織化學及逆轉錄PCR(RT-PCR)法檢測人OA軟骨和正常軟骨中Sirt1的表達，Ⅱ型膠原酶消化軟骨獲得軟骨細胞，單丹磺酰尸胺(MDC)法檢測OA軟骨細胞及正常軟骨細胞自噬水平，并分析二者相關性；Sirt1激動劑白藜蘆醇干預OA軟骨細胞，并通過MDC法檢測OA軟骨細胞自噬水平，Western blot及RT-PCR法檢測酵母自噬基因Atg/Vps30同源基因(Beclin-1)及微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)蛋白及mRNA表達水平，煙酸己可堿(Hoechst)染色檢測OA軟骨細胞凋亡情況，Western blot檢測B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路激活情況，分光光度法檢測各組天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)活性。結果OA軟骨中Sirt1蛋白及mRNA表達量都顯著低于正常軟骨中表達量(P<0.01)，OA軟骨細胞自噬水平低于正常軟骨細胞(P<0.01)，OA中軟骨Sirt1表達量與自噬水平正相關；Sirt1激動劑白藜蘆醇能顯著提高OA軟骨細胞自噬水平(P<0.01)，提高自噬基因Beclin-1及LC3蛋白及mRNA表達量(P<0.01)，并抑制mTOR磷酸化(P<0.01)，從而抑制OA軟骨細胞凋亡(P<0.01)，下調Bax表達(P<0.01)，上調Bcl-2表達(P<0.01)，降低Caspase-3活性(P<0.01)。結論Sirt1在OA中低表達，并與軟骨細胞自噬水平正相關，提高Sirt1表達水平后能顯著能夠顯著抑制OA自噬，并抑制OA軟骨細胞凋亡，這可能是通過mTOR信號通路實現的。

[關鍵詞]骨關節炎；軟骨細胞；自噬；沉默信息調節因子1

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種多發于老年人的慢性退行性關節疾病，以關節軟骨破壞和關節周圍骨質增生為主要病理特征，主要與年齡、性別、遺傳因素等有關[1-3]。目前OA發病機制主要圍繞在關節軟骨如何維持細胞和細胞外基質代謝的動態平衡上，而近年來也發現自噬在OA發病過程中起著重要作用[4-5]。沉默信息調節因子1(silent information regulation of transcription 1，Sirt1)是sirtuins家族研究最為廣泛的一員，在神經退變性疾病、糖尿病、腫瘤、炎癥、衰老等疾病中通過自噬參與其病理過程[6]。此外Sirt1在人OA軟骨細胞外基質合成、細胞存活，以及抗炎作用中起著重要作用[7-8]，并能通過對自噬相關蛋白去乙酰化從而調節細胞自噬水平[6,9]。因此推測，Sirt1可能通過調節OA軟骨細胞自噬水平從而參與軟骨細胞凋亡。所以本研究擬探討Sirt1是否通過調控OA軟骨細胞自噬，從而為Sirt1成為OA治療靶點提供理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料軟骨組織取自2014年8月至2015年8月本院骨科進行膝關節置換術的30名OA患者(根據美國風濕性學會2008年制訂的OA診斷標準，通過病史、臨床檢查和X線片確診)。其中，男12例，女18例，年齡57～86歲，平均70歲。正常關節軟骨10例，取自因創傷根據截肢的膝關節股骨頭軟骨，根據病史，術前X線片及術后肉眼觀察排除標本退行性變，腫瘤、感染、類風濕炎癥和明顯骨質疏松等結構性破壞。正常關節軟骨中，男7例，女3例，年齡19～42歲，平均31歲。患者對取材知情并同意，本試驗亦經醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器兔抗Sirt1人多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及p-mTOR單克隆抗體購自Epitmics公司；鼠抗甘油醛3-磷酸脫氫酶(GADPH)抗體，含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶3(Caspase-3)檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；兔抗酵母自噬基因Atg/Vps30同源基因(Beclin-1)及微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)多克隆抗體購自Abcam公司；白藜蘆醇購自Sigma公司；Ⅱ型膠原酶，胎牛血清，達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養基(DMEM/F-12)購自Gibco公司。ChemiDocTMXRS凝膠成像系統購自Bio-Rad公司；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標儀購自瑞士TECAN集團公司，AF6000熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2.2免疫組織化學檢測標本經二甲苯脫蠟，100%、95%、80%乙醇脫水，流水沖洗，抗原修復，馬血清進行抗原封閉，一抗封閉，二抗封閉，蘇木素浸泡，鹽酸乙醇浸泡，流水沖洗至反藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，吹干后中性樹膠封片，后鏡檢。Sirt1陽性染色為淡黃色、棕黃色，定位于細胞核。

1.2.3逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測總RNA的提取參考Trizol試劑盒 (Invitrogen) 使用說明書，整個提取處于無RNAase的環境下。引物設計見表1，通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA并進行PCR擴增，獲取5 μL擴增產物用于下一步2%的瓊脂糖膠進行檢測并拍照。引物分別加入25 μL PCR反應體系中，反應條件為94 ℃變性45 s，59 ℃復性45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環。

1.2.4軟骨細胞的制備及分組[1-2]無菌環境下，充分漂洗軟骨組織標本，用眼科剪剪碎至1 mm3大小。并依次用0.25%的胰蛋白酶及0.20%的膠原酶分別消化30 min 及2 h。獲得單細胞懸液后，用10%胎牛血清的DMEM/F-12培養基重懸細胞，37 ℃和5% CO2培養箱中培養，約4～5 d細胞開始融合，實驗使用第2～3代細胞。細胞分為OA組及Sirt1激動劑白藜蘆醇組(白藜蘆醇組)。

1.2.5單丹磺酰尸胺(MDC)染色細胞自噬囊泡體能與MDC特異性結合，在熒光顯微鏡下呈藍色。于6孔板中制備OA軟骨細胞爬片，于37 ℃和5% CO2培養箱中培養24 h，再加入10 μmol/L白藜蘆醇或不加任何刺激物進行干預培養24 h后，加入0.05 mmol/L MDC于37 ℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，并置于含有防熒光猝滅劑的載破片上，避光作用5～10 min后，熒光顯微鏡下觀察拍照。

表1　RT-PCR引物

1.2.6煙酸已可堿(Hoechst)染色將OA軟骨細胞培養于6孔板，于37 ℃和5% CO2培養箱中培養24 h后，加入10 μmol/L白藜蘆醇或不加任何刺激物進行干預培養24 h，后按照Hoechst染色試劑盒說明書進行操作，染色，固定，顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.2.7Western blot檢測將OA軟骨細胞培養于6孔板，于37 ℃和5% CO2培養箱中培養24 h后，加入10 μmol/L白藜蘆醇或不加任何刺激物進行干預培養24 h。收集細胞，加入裂解液裂解，冰浴30 min，每隔10 min震蕩5 s，以1×104r/min 4 ℃離心15 min，獲得蛋白樣品。根據二喹啉甲酸(BCA)試劑盒對蛋白濃度進行測定。蛋白上樣，十二烷基磺酸鈉(SDS)凝膠電泳，后濕法轉膜。將膜浸入一抗溶液孵育，4 ℃過夜；漂洗后，浸入二抗溶液(1∶100)中室溫孵育1～2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統中曝光。用“Quantity one”軟件對各抗體條帶灰度值進行統計。

1.2.8Caspase-3活性檢測將OA軟骨細胞培養于6孔板，于37 ℃和5% CO2培養箱中培養24 h后，加入10 μmol/L白藜蘆醇或不加任何刺激物進行干預培養24 h，按Caspase-3分光光度法檢測試劑盒進行檢測。

2結果

2.1Sirt1蛋白及mRNA在人OA軟骨及正常軟骨組織中的表達與正常軟骨組織比較，OA軟骨組織中Sirt1蛋白陽性表達顯著降低(5.42±0.43vs.2.87±0.25)，OA軟骨組織中Sirt1 mRNA表達亦顯著降低(0.98±0.09vs.0.38±0.06)，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖1、2。

A：正常軟骨組織；B：OA軟骨組織。

圖1Sirt1蛋白在人OA軟骨及正常軟骨組織中的表達

*:P<0.01，與正常軟骨細胞比較。

圖2Sirt1mRNA在人OA軟骨及正常軟骨組織中的表達

2.2OA軟骨細胞及正常軟骨細胞中自噬水平與正常軟骨細胞比較，OA軟骨細胞自噬水平降低[(30.45±5.17)%vs.(6.35±0.45)%,P<0.01]，見圖3。

A：正常軟骨細胞；B：OA軟骨細胞。

圖3OA軟骨細胞及正常軟骨細胞中自噬水平

2.3OA軟骨細胞中Sirt1表達自噬水平的相關性Person分析結果發現，OA軟骨細胞中Sirt1表達量與自噬水平正相關(r=0.783，P<0.01)。

A：OA組；B：白藜蘆醇組。

圖4Sirt1表達上調后對OA軟骨細胞凋亡的影響

*：P<0.01，與OA組比較。

圖5Sirt1表達上調后對OA軟骨細胞中自噬蛋白表達量的影響

2.4Sirt1表達上調后對OA軟骨細胞中自噬水平的影響與OA軟骨細胞組織比較，白藜蘆醇刺激Sirt1表達上調后，OA軟骨細胞自噬水平升高[(6.49±0.53)%vs.(26.89±3.12)%,P<0.01]。并使凋亡自噬基因Beclin-1及LC3蛋白及mRNA表達量上調(P<0.01)，見圖4、5。

A：OA組；B：白藜蘆醇組。

圖6Sirt1表達上調后對OA軟骨細胞凋亡的影響

*：P<0.01，與OA組比較。

圖7Sirt1表達上調后對OA軟骨細胞中Bax及Bcl-2表達量的影響

*：P<0.01，與OA組比較。

圖8Sirt1表達上調后對OA軟骨細胞中>Caspase-3活性的影響

*：P<0.01，與OA組比較。

圖9Sirt1表達上調后對OA軟骨細胞mTOR信號通路的影響

2.5Sirt1表達上調后對OA軟骨細胞凋亡的影響與OA軟骨細胞組比較，白藜蘆醇刺激Sirt1表達上調后，OA軟骨細胞凋亡率顯著下降[(28.71±3.24)%vs.(6.76±0.39)%,P<0.01)]，并上調Bcl-2蛋白表達(P<0.01)，下調Bax蛋白表達(P<0.01)，抑制Caspase-3活性(P<0.01)，見圖6～8。

2.6Sirt1表達上調后對OA軟骨細胞mTOR信號通路的影響與OA軟骨細胞組比較，白藜蘆醇刺激Sirt1表達上調后，OA軟骨細胞中mTOR磷酸化水平顯著降低(P<0.01)，見圖9。

3討論

細胞自噬是生物體在生理或病理條件下的應激反應，可通過溶酶體清除受損或老化的細胞器，從而維持細胞內外環境穩定和代謝平衡。研究發現，自噬功能的缺失或增強，在神經性疾病、骨骼肌病變、腫瘤、炎癥及衰老等病理過程中起著重要作用[6]。自噬也可稱之為Ⅱ型程序性細胞死亡，參與OA軟骨退變，Caramés等[10]研究發現小鼠OA模型中自噬相關蛋白ULK1，Beclin1，LC3的表達量減少。Almonte-Becerril等[11]通過免疫組織化學和Western blot證實動物OA模型中同時存在細胞凋亡及細胞自噬。后續的研究也證實通過提高OA自噬水平能顯著的抑制OA軟骨退變[12]。本研究結果與上述報道一致，OA軟骨細胞中自噬水平顯著低于正常軟骨細胞。所以研究軟骨細胞自噬作用機制有助于一步了解OA發病機制，同時也為OA治療提供新的思路。

研究已證實Sirt1與OA的發生、發展密切相關。如Fujita等[13]證實OA關節軟骨細胞比正常關節軟骨細胞中表達量降低。與本研究結果相一致，在人OA軟骨組織Sirt1表達量顯著低于正常軟骨組織。同時Matsuzaki等[14]證實Sirt1-CKO小鼠比野生型8周C57BL6/J小鼠更容易發展為OA，并伴隨著膠原X，人基質金屬蛋白酶13(MMP-13)水平的上升，提示軟骨細胞中Sirt1的缺失加速小鼠OA模型的形成。Gabay 等[15]進一步證實Sirt1 KO小鼠軟骨表達發生變化，凋亡程度提高，軟骨退變加速。Gagarina等[16]證實Sirt1能促進OA軟骨特異性基因表達。說明Sirt1在OA中起著保護性作用。本研究進一步通過Person分析發現，OA軟骨中Sirt1低表達水平與低自噬水平正相關，同時Marino等[9]提出Sirt1能通過調節自噬蛋白乙酰化水平或蛋白水平來調控細胞的自噬水平。Powell等[17]進一步研究Sirt1促進前列腺癌細胞自噬體成熟。從而說明OA中Sirt1不僅與軟骨自噬水平相關，還可參與調控軟骨細胞自噬。所以，在此基礎上本研究進一步探討Sirt1對于OA自噬水平的調控作用。

Li等[18]證實白藜蘆醇通過提高OA小鼠中Sirt1活性，降低缺氧誘導因子2α(HIF-2α)，MMP13及一氧化氮合成酶(iNOS)表達，從而抑制OA小鼠軟骨退變。siRNA干擾人軟骨細胞中Sirt1的表達，促使TUNEL陽性細胞數目，聚ADP核糖聚合酶(PARP)及Caspases-3，9片段數量，Bax表達量都顯著提高，Bcl-2表達量下降，而白藜蘆醇激活Sirt1表達，能扭轉此變化[19]。從而說明Sirt1有可能通過上調OA軟骨細胞自噬水平，達到抑制軟骨細胞凋亡的作用。因此本研究采用Sirt1激動劑白藜蘆醇干預OA軟骨細胞，結果表明白藜蘆醇能使OA軟骨細胞自噬水平顯著提高，同時自噬蛋白Beclin1及LC3表達量顯著上調。進一步檢測OA凋亡情況，結果表明OA軟骨細胞凋亡率下降。Bax表達量顯著降低，Bcl-2表達量顯著上升，Caspase-3活性下降，說明Sirt1能通過調節OA軟骨細胞自噬水平影響OA軟骨細胞凋亡。

細胞的自噬作用受多種信號通路的影響，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，mTOR信號通路，Bcl-2信號通路等。其中mTOR信號研究最為廣泛，已經證實mTOR信號通路能調控腎臟上皮細胞，心肌細胞，神經膠質細胞，腫瘤細胞，淋巴細胞等多種細胞中自噬功能的產生[20]。Bohensky等[21]證實通過HIF/AMPK/mTOR信號途徑調節軟骨細胞自噬。Caramés等[22]研究證實mTOR抑制劑雷帕霉素可以通過誘導自噬起到保護OA軟骨的作用。Zhang等[23]也發現通過阻斷mTOR信號通路可以防止大鼠OA的發生。因此本研究探討了白藜蘆醇刺激OA軟骨Sirt1表達上調后，mTOR信號通路的激活情況，結果表明白藜蘆醇干預后，OA軟骨細胞中mTOR磷酸化水平顯著提高。同時mTOR信號通路對細胞增殖也具有調控作用[24]。并且Zhao等[25]證實外源性刺激單倍體干細胞能促進Sirt1表達，且是通過mTOR通路產生的，而單倍體干細胞中Sirt1敲除后，會導致細胞凋亡并伴隨p53及Caspase-3的激活。從而推測Sirt1不僅通過阻斷mTOR信號通路來干擾OA軟骨細胞的自噬水平，也通過此信號通路來干預OA軟骨細胞凋亡情況。

綜上所述，Sirt1在OA軟骨組織中低表達，并與軟骨細胞自噬水平正相關，通過上調Sirt1表達水平，可顯著上調OA軟骨細胞自噬水平，并進一步抑制細胞凋亡及調控凋亡相關蛋白的表達，此過程可能與mTOR信號通路有關。

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作者簡介：李春亮(1978-)，主治醫師，碩士，主要從事四肢創傷研究。 △通訊作者，E-mail:lizhaowei5120@sina.com。

doi:·經驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.029

[中圖分類號]R684.3

[文獻標識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)15-2118-05

(收稿日期：2015-11-08修回日期：2016-02-11)