自噬在不同強度運動影響關節軟骨細胞功能中的作用

劉申申等

摘要：目的： 探討自噬在不同運動強度影響關節軟骨細胞功能中的作用。方法： 將 SD 大鼠隨機分為 4 組： 高強度運動組、中等強度運動組、低強度運動組和對照組，其中的三個運動組大鼠均進行每天 1 h持續 8 w 的跑臺運動，運動速度分別為 35 m/min、 25 m/min、 15 m/min，對照組不進行運動干預。分組干預結束后處死大鼠， 取左后肢膝關節軟骨組織提取總 RNA 和蛋白，利用 qRT-PCR法檢測蛋白多糖和 II 型膠原纖維 mRNA 水平，利用 Western blot 法測定自噬相關標志蛋白 Beclin-1 和微管相關蛋白 1 輕鏈 3（ microtubule-associated protein 1

light chain 3， LC3）的蛋白水平。 結果： 與對照組相比， 低強度和中等強度運動組大鼠膝關節軟骨外觀無明顯差異，蛋白多糖和 II 型膠原纖維 mRNA 水平以及Beclin-1 和 LC3-II/I 蛋白水平明顯升高；而高強度運動組大鼠膝關節中出現少量積液，滑膜腫脹，關節軟骨表面出現散在微小裂痕和纖維化表現，蛋白多糖和 II型膠原纖維 mRNA 水平以及 Beclin-1 和 LC3-II/I 蛋白水平顯著降低。 結論： 低強度和中等強度運動可以通過促進自噬維持軟骨細胞分泌功能，而高強度運動則會誘發自噬缺陷并造成軟骨組織破壞。

關鍵詞：運動；運動強度；關節軟骨； 軟骨細胞；自噬

中圖分類號：G8042文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2015）02-0074-05

Abstract：Objective： To determine the role of autophagy in the regulation of articular chondrocyte function with exercises of different intensityMethods：The rats were randomly divided into 4 groups： high， moderate， low intensity exercise groups and the control group The rats of exercise groups were trained in the form of treadmill running， 1 h/d for 8 weeks， with 35 m/min， 25 m/min， and 15 m/min respectively And the rats of the control group were not trained at all Finally， the knee articular cartilage of the left hind limb was harvested to determine the mRNA level of proteoglycan and type II collagen， and the protein level of Beclin-1 and microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3）Results：Compared with the control group， the gross appearance of the cartilage did not differ in the rats of moderate and low intensity exercise groups And the mRNA levels of proteoglycan and type II collagen and the protein level of Beclin-1 and LC3-II/I were all significantly

收稿日期：2014-11-11

基金項目：[河北省高等學校科學技術研究項目（ Z2013009）。

作者簡介：[劉申申（1981-），男，河北文安人，碩士，講師，研究方向體育教學與訓練。

作者單位：[1廊坊師范學院體育學院，河北 廊坊065000；2北京中醫藥大學東方學院，河北 廊坊065000

1School of Physical Education， Langfang Teachers University， Langfang 065000， Hebei， China；2Oriental College，Beijing University of Chinese Medicine，Langfang 065001

upregulated As a contrast， the mRNA and protein levels of those proteins were all significantly decreased， accomplished with arthroedema and cartilage destructionConclusion：The secretory function of the chondrocyte may be improved by low to moderate intensity exercise via an autophagy-dependent manner； however， autophagy defect may be induced by high intensity exercise to mediate cartilage destruction

Key words：exercise；exercise intensity；articular cartilage； chondrocyte； autophagy

[FL（K2]

關節是骨與骨相連接的部位，作為關節的重要組成部分，關節軟骨發揮著減輕骨與骨之間摩擦和緩沖運動時產生震動的作用。 膝關節是人體主要的負重關節之一，因此，膝關節軟骨除發揮上述作用外，還承擔著負重的作用。隨著年齡的增長， 累積性運動損傷、關節創傷和制動、關節退行性改變和局部炎癥免疫反應等因素共同作用，誘使膝關節出現軟骨破壞、關節表面骨贅形成、滑膜細胞增生、關節間隙狹窄等病理改變，即誘發骨關節炎[1]。 骨關節炎是一種常見的慢性關節疾病， 累積性微小損傷、肥胖和負重等外因參與誘導骨關節炎的發病過程，但其具體在骨關節炎發病過程中的作用尚未明確

自噬是細胞為維持自身穩態而選擇性降解受損細胞器和生物大分子的一種應激調控機制，當各種應激因素刺激引起細胞損傷時， 細胞自噬水平代償性提高，細胞主動清除受損的線粒體、內質網和核糖體等細胞器，從而有效延緩或阻斷細胞凋亡的發生，有助于細胞功能乃至組織整體功能的維持和恢復[4-6]。 目前研究已經證實，自噬在正常軟骨組織中發揮保護性作用，參與局部穩態的維持， 而原發性骨關節炎和年齡、手術相關骨關節炎患者膝關節軟骨局部自噬水平明顯降低，并可能與軟骨細胞凋亡有關[7-8]。然而，自噬在運動相關性累積性微小損傷誘發骨關節炎的發病過程中的作用尚無研究闡明，為了明確上述問題，設計了如下實驗。本實驗擬利用動物實驗探討不同運動強度運動對大鼠膝關節軟骨細胞自噬和軟骨細胞分泌功能的影響，以闡明自噬在運動相關性軟骨損傷乃至骨關節炎發病過程中的作用。

1材料和方法

1.1動物和材料健康清潔級 8 周齡雄性 SD 大鼠 48 只（體重 180 g～230 g） 購自 西安交通大學醫學院實驗動物中心； BW-ZH-PT 型動物跑臺購自上海軟隆科技發展有限公司； RNA 逆轉錄試劑盒和 SYBR 熒光試劑盒均購自日本 TaKaRa 公司； RIPA 裂解液購自西安沃爾森生物科技有限公司； 兔抗大鼠Beclin-1 多克隆抗體和兔抗大鼠 LC3 多克隆抗體購自美國Abcam 公司，兔抗大鼠 β-actin 抗體購自美國 Santa Cruz公司； 常規試劑均為國產分析純。

1.2分組和干預所有動物的飼養均在西安交通大學醫學院實驗動物中心完成，飼養條件滿足環境溫度 20℃～25℃和相對濕度 50%～55%的條件。經過適應性喂養1 w后， 將所有大鼠隨機分為4組： 高強度運動組、中等強度運動組、低強度運動組和對照組（均為n=12）。其中，三個運動組的大鼠均進行每天 1 h持續8w的跑臺運動， 運動強度的確定參照 Bedford 等人所用方法[9]。高強度運動組運動速度為 35 m/min，中等強度運動組運動強度為 25 m/min，低強度運動組運動強度為 15 m/min，對照組不進行運動干預。

1.3標本采集和處理 分組干預結束后， 統一斷頭處死各組大鼠，迅速切取左后肢膝關節軟骨， 觀察關節軟骨表面形態特征，隨后立即放入液氮中保存，后期用于提取總 RNA 和總蛋白，分別測定軟骨組織 II 型膠原纖維 mRNA、蛋白多糖mRNA 以及 Beclin-1 和微管相關蛋白 1 輕鏈 3（ microtubule-associated protein 1light chain 3， LC3）蛋白水平。

1.4改良異硫氰酸胍一步法提取總 RNA 參照馬秦和邱蔚六等人所報道的方法提取軟骨組織總 RNA[10]，具體步驟如下：切取約 2 g 軟骨組織，在液氮中研碎，加入20 mL含4 mol/L異硫氰酸胍的混合液（含25 mmol/L 檸檬酸鈉、 5 g/L 十二烷基磺酸鈉和 01 mol/L 巰基乙醇），室溫緩慢震蕩 4 h；再分別加入水飽和酚20 mL、 2 mol/L 醋酸鈉溶液 2 mL 和含 20 mL/L 異戊醇的氯仿 5 mL，室溫劇烈震蕩 10 s 后立即放入冰水混合物中孵育 15 min； 12 000 g離心15 min，將上層無色透明的樣本轉移到新的 EP管中，加入等體積異丙醇，充分混勻后室溫下孵育10 min，再次離心；棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀1次，將所提取 RNA 沉淀晾干后，加入 50 μL DEPC溶解RNA，于紫外分光光度計測定RNA純度，保證A260/280不超過 16，RNA樣本保存于-80℃冰箱備用。

1.5總蛋白提取將約 01 g 軟骨組織在液氮中研碎后，加入 998 μL RIPA 裂解液（含 1 μL 苯甲磺酰氟），冰上裂解 30 min；將裂解液轉移至 EP 管中， 4℃ 14 000 g離心20 min，將上清液轉移到新EP管中；加入 1/4 體積 5× 十二烷基磺酸鈉上樣緩沖液， 95℃ 10 min 使蛋白變性， 保存于-20℃冰箱中備用。

1.6qRT-PCR分別按照以下基因序列合成引物：II型膠原纖維為5-CGAGGTGACAAAGGAGC-3（正義），5-CTGGTTGTTCAGCGACTTGA-3（反義）；蛋白多糖為 5-CGCTTGCCAGGGGGAGTTGTATTC-3 （正義），5-GGAGGCCAGGGTAGCATTTTGAGC-3 （ 反 義 ）； 內 參 GAPDH 為5-GATGGTGAAGGTCGGTGTG-3（正義）， 5-GAGGTCAATGAAGGGGTCG-3（反義）。設置微量反轉錄反應體系，將 RNA 反轉錄為 cDNA，在 iQ5 熒光定量RT-PCR 儀上進行 PCR 反應。每個實驗重復進行 5 次，每次設置 3 個復孔，以2-ΔΔC（t）法計算目的基因相對表達量，以 GAPDH 為內部對照。

1.7Western blot利用Bradford 法測定蛋白濃度， 取等質量的關節軟骨總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳； 以半干轉法將蛋白轉印到 PVDF 膜， 室溫下常規封閉處理2 h，隨后分別用抗Beclin-1抗體（1[JX-4]：[JX4]100）、抗LC3抗體（1[JX-4]：[JX4]2 000）或β-actin單克隆抗體（1[JX-4]：[JX4]3 000）4℃孵育過夜，用含Tween-20的磷酸鹽緩沖液洗滌后，在室溫下加入1[JX-4]：[JX4]8 000稀釋的生物素標記的山羊抗兔IgG抗體孵育2 h，用含Tween-20 的磷酸鹽緩沖液充分洗滌后，用ECL法顯影，在Image-Pro Plus 軟件中分析各蛋白條帶的積分吸光度值，以β-actin為內對照，目的蛋白與內對照灰度值的比值代表該樣本目的蛋白的相對表達量， 以3次重復檢測所得平均值為該樣本目的蛋白表達水平，樣本量為n=5。

1.8統計學分析采用SPSS180統計軟件分析，數據以均數±標準差表示， 兩組間比較采用 t 檢驗，以P<005 為差異有統計學意義的判定標準。

2結果

2.1大鼠膝關節軟骨大體形態特征

經過 8 w 不同強度運動后， 對照組與低強度、中等強度運動組大鼠膝關節中無明顯關節積液，關節軟骨表面光滑，滑膜無腫脹，未見軟骨表面出現裂痕或纖維化表現；而高強度運動組膝關節腔內可見少許積液，滑膜腫脹，關節軟骨表面可見散在微小裂痕和纖維化表現。

2.2大鼠膝關節軟骨細胞分泌功能測定

基質和纖維成分是關節的主要組成部分， 主要由軟骨細胞合成并分泌。在骨關節炎發病過程中，軟骨細胞合成分泌蛋白多糖和II型膠原纖維不足，導致軟骨表面破損后不能及時修復，直接引發關節功能降低。為了探索不同強度運動對軟骨細胞分泌功能的影響以及自噬在其中的作用，本實驗利用 qRT-PCR 法測定了各組大鼠膝關節軟骨蛋白多糖和 II 型膠原纖維的 mRNA 表達水平。結果如圖1 所示，與對照組相比，低強度和中等強度運動組大鼠膝關節軟骨中蛋白多糖mRNA 表達水平明顯升高，但高強度運動組顯著降低（均為P<005）。 各組大鼠II 型膠原纖維水平變化趨勢大致與蛋白多糖相似，低強度和中等強度運動可促使II 型膠原纖維表達水平升高，而高強度運動則顯著抑制其表達水平（均為P<005，圖2）。

2.3大鼠膝關節軟骨自噬水平測定

LC3 是大鼠軟骨細胞自噬體形成所必需的組分，在自噬體膜的延長和融合中發揮重要的作用，也因此被視為自噬水平的標志物[11 -12]。Beclin-1 是哺乳動物自噬調控的重要分子，主要參與調節其他自噬蛋白向前自吞噬體膜的募集和定位[13]。為了探討不同運動強度對大鼠膝關節軟骨自噬水平的影響， 本實驗利用Western blot 法測定了關節軟骨中自噬標志物Beclin-1 和 LC3 的蛋白水平。結果如圖 3 所示，與對照組相比，低強度和中等強度運動組大鼠膝關節軟骨中 Beclin-1和LC3 的蛋白水平明顯升高，而高強度運動組則顯著降低（均為P<005）。

3討論

適當運動有助于維持關節軟骨生理功能，而高強度運動可直接引起關節軟骨損傷，甚至誘發骨關節炎，然而不同強度運動影響關節軟骨功能的機制目前尚未明確[14]。本實驗研究發現低強度和中等強度跑臺運動可以上調膝關節軟骨自噬水平，而高強度跑臺運動卻顯著抑制軟骨自噬，軟骨細胞分泌功能也出現相同的變化趨勢，這說明自噬可能是不同強度運動調節軟骨細胞分泌功能的機制之一。

隨著現代生活節奏的加快、生活習慣的西方化和戶外運動的減少，亞健康群體正在日益擴大。體育運動具有預防和消除亞健康的作用，是促進機體從亞健康狀態向軀體健康和心理健康發展的重要手段。近年來，人們主動參加戶外活動，提高身心健康水平的意愿愈發強烈，選擇適宜的運動強度和方式則成為影響戶外活動效果的重要因素[15]。既往研究表明，中等強度有氧運動可以顯著改善軟骨細胞合成和分泌糖胺多糖， 維持軟骨組織正常功能，并具有促進軟骨重建的功能[16]。 進一步研究表明，中等強度運動主要通過增加軟骨中基質成分（主要為蛋白多糖和 II 型膠原纖維）的表達和合成而實現促進軟骨塑性的保護作用[17-19]。本實驗利用 SD 大鼠跑臺運動構建不同運動強度的動物模型，結果發現低強度和中等強度運動均可促進軟骨細胞合成和分泌蛋白多糖和 II 型膠原纖維， 這可能是運動造成軟骨磨損和基質消耗后，軟骨細胞自身的代償性保護機制。

[JP+1]自噬是真核細胞中物質分解代謝的主要途徑之一，正常細胞中自噬處于較低水平，而當線粒體和內質網等細胞器自然衰老或受損傷后，細胞主動啟動自噬相關信號分子，形成自噬體并與溶酶體結合，清除上述細胞器及生物大分子[20]。既往研究表明，適當的自噬水平有助于顯著線粒體合成并釋放過多的活性氧，并可以維持線粒體功能，防止出現細胞凋亡[21]。本實驗發現低強度和中等強度跑臺運動可以明顯提高軟骨組織自噬相關標識蛋白 Beclin-1 和 LC3 的表達水平，這說明適當運動可以提升軟骨細胞自噬活性，有助于清除運動中受損的細胞器或細胞外基質，維持軟骨組織局部穩態，而軟骨組織穩態的維持也是保證軟骨細胞代償性合成并分泌蛋白多糖和 II 型膠原纖維的重要前提和基礎。因此，自噬水平的提高可能是低強度和中等強度運動改善軟骨代謝的重要機制之一，這為適當運動方式的選擇提供了科學的實驗依據。[JP]

與低強度和中等強度運動不同，高強度運動主要見于專業運動員。長期從事高強度的沖擊性或扭轉剪切性運動難免造成膝關節等部位的運動損傷，甚至可以誘發骨關節炎等疾病。膝關節運動損傷主要表現為半月板磨損或撕裂、韌帶撕裂或斷裂，在上述疾病發生過程中，關節軟骨損傷最常見。 關于高強度運動誘發膝關節軟骨損傷的機制研究已經發現：高強度運動可以誘導基質金屬蛋白酶3表達升高[22]，抑制基質金屬蛋白酶抑制劑 1 的表達[23]，從而促進軟骨基質的降解。然而，高強度運動是否影響軟骨細胞合成基質成分的能力以及自噬在其中的作用均未完全闡明，本實驗結果提示高強度運動可以下調 Beclin-1 和 LC3 蛋白水平，誘導軟骨自噬缺陷，這一現象可能會造成軟骨組織局部物質分解代謝能力不足，引起受損細胞器和無活性生物大分子蓄積，誘導軟骨細胞凋亡，進而加重軟骨基質成分合成不足，造成惡性循環，參與運動性軟骨損傷和骨關節炎的發病過程[24]。

4總結

綜合上述實驗結果，低強度和中等強度運動可以誘導軟骨自噬活性并發揮一定的保護作用，而高強度運動可引起軟骨自噬缺陷繼而誘導軟骨損傷，這說明不同運動強度對軟骨自噬水平的不同調節作用可能是其對軟骨功能影響截然不同的機制之一。本研究結果也為進一步探討自噬在運動相關性軟骨損傷和骨關節炎發病過程中的作用提供了一定的科學依據， 而繼續研究運動影響自噬的分子機制將是本課題組下一步的研究方向。

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