利用分子信標檢測microRNA并成像肺癌干細胞的實驗研究*

朱海振，耿　濤，李雪濤，林　盛，韓　靜，江飛龍，陳光朋，譚詩生△，陳正堂▲

(1.貴州省人民醫院腫瘤科，貴陽 550002；2.第三軍醫大學新橋醫院全軍腫瘤研究所，重慶 400037；3.瀘州醫學院附屬醫院腫瘤科，四川瀘州 646000)

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利用分子信標檢測microRNA并成像肺癌干細胞的實驗研究*

朱海振1，耿濤1，李雪濤2，林盛3，韓靜2，江飛龍2，陳光朋2，譚詩生1△，陳正堂2▲

(1.貴州省人民醫院腫瘤科，貴陽 550002；2.第三軍醫大學新橋醫院全軍腫瘤研究所，重慶 400037；3.瀘州醫學院附屬醫院腫瘤科，四川瀘州 646000)

[摘要]目的利用miR-155分子信標(MB)檢測CD133+CD326+肺癌干細胞(LCSCs)中高表達的miR-155并成像肺癌干細胞。方法采用對A549細胞逆向誘導及紫杉醇富集的方法，通過流式細胞儀從A549細胞中分選出CD133+CD326+細胞，并對其干性進行鑒定。以殼聚糖納米(CS)作為載體轉染miR-155 MB，激光共聚焦顯微鏡檢測miR-155 MB對LCSCs中miR-155的識別功能并成像，并采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)進一步驗證。結果分選的CD133+CD326+細胞在干細胞培養基中成球生長，干性相關基因CD133、CD326、OCT-4、Nanog表達為A549細胞的3.27、3.39、6.01、3.42倍(P<0.05)，在細胞數為1×104數量下仍具備成瘤能力。CS轉染miR-155 MB后在A549及LCSCs中均可看到較強的紅色熒光，以LCSCs中熒光信號最強(P<0.05)，且熒光信號強弱趨勢與qRT-PCR檢測的miR-155的表達趨勢較一致。結論利用miR-155 MB能夠檢測LCSCs中高表達的miR-155并使其成像，為監測并發現肺癌干細胞提供新思路。

[關鍵詞]腫瘤干細胞；肺腫瘤；A549；分子信標

近年來，我國肺癌發病率呈快速增長趨勢[1]。目前臨床上尚缺乏特異的、敏感的肺癌早期診斷分子靶標。腫瘤干細胞被認為是腫瘤產生、發展、復發、轉移的根源,尋找肺癌干細胞有可能成為早期診斷的新突破點[2]。大量研究表明微小RNA(miRNA)廣泛參與了腫瘤的發生、發展、轉移等，識別肺癌干細胞相關miRNA并使之成像有可能成為肺癌早期診斷的重要策略[3]。分子信標(MB)是一種分子內互補形成發卡結構的熒光標記的寡核苷酸序列，是一個非常敏感的檢測DNA、RNA和miRNA的方法，已被廣泛用于基因定量分析、疾病診斷和活體成像等研究領域[4]。因此，本研究擬利用miR-155 MB檢測CD133+CD326+肺癌干細胞(LCSCs)中高表達的miR-155并成像LCSCs，為監測并發現LCSCs提供新的理論依據。

1材料與方法

1.1材料A549肺腺癌細胞系購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)。選擇6周齡健康裸鼠，由第三軍醫大學新橋醫院動物中心提供。主要試劑：PRMI-1640、DMEM/F12培養基購自Hyclone公司；重組人胰島素、重組人堿性成纖維生長因子(bFGF)、牛血清清蛋白(BSA)粉劑購自美國Sigma公司；重組人表皮生長因子(EGF)購自美國Pepro Tech公司；標準胎牛血清(FBS)購自天津灝洋；鼠抗人CD133-PE、CD326-FITC流式抗體購自德國美天旎；山羊抗人CD326一抗購自美國Santa Cruz；兔抗人CD133購自美國abcam；逆轉錄及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自日本 TaKaRa公司；CD133、CD326、OCT-4、Nanog引物，部分堿基經過鎖核酸修飾的miR-155 MB，陰性對照隨機序列分子信標(RS MB)即不和任何基因組序列結合的RS MB由上海生工合成；hsa-miR-155引物購于廣州銳博生物公司；殼聚糖納米(CS)由四川廣漢恒宇新材料公司惠贈。

1.2方法

1.2.1CD133+CD326+細胞的分選及培養CD133+CD326+細胞培養液DMEM/F12的配置：500 mL的DMEM/F12培養基內加入2 g BSA，500 μL(50 μg/μL)重組人胰島素，500 μL(20 ng/μL)EGF，500 μL(10 ng/μL)bFGF，5 mL青霉素-鏈霉素雙抗。根據本課題組前期研究報道的分選干細胞[2]的方法，對A549細胞進行逆向誘導及紫杉醇富集，富集后根據抗體說明書，加入相對應的鼠抗人CD133-PE和CD326-FITC流式抗體，濃度為1∶11，37 ℃水浴鍋內孵育30 min，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌后，避光流式細胞儀上機分選，分選后置入干細胞培養液中培養并進行形態學觀察。

1.2.2免疫熒光取成球生長的CD133+CD326+細胞懸液，滴在載玻片并進行甩片，800 r/min，離心5 min，4%的多聚甲醛固定10 min，漂洗后滴加0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton)液，洗滌后滴加5%BSA封閉液，37 ℃孵育20 min，加入PBS稀釋的一抗兔抗人CD133和山羊抗人CD326，濃度均為1∶200，于4 ℃冰箱孵育過夜，充分漂洗后加入羊抗兔CD133-FITC及驢抗山羊CD326-CY3二抗，二抗的濃度均為1∶400，37 ℃孵育30 min，漂洗后4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染細胞核，抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察CD133和CD326的表達并拍照。

1.2.3干性基因檢測根據干細胞相關基因Oct-4、Nanog、CD133、CD326序列設計qRT-PCR引物，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參，引物均由上海生工合成，序列如下：GAPDH上游5′-CCA CTC CTC CAC CTT TGA C-3′，下游5′-CCA CTC CTC CAC CTT TGA C-3′；CD326上游5′-AGT AAA AGT TTG CGG ACT GCA C-3′，下游5′-CTG GAA ATA ACC AGC ACA ACA A-3′；CD133上游5′-TCT CTA TGT GGT ACA GCC G-3′，下游5′-TGA TCC GGG TTC TTA CCT G-3′；Nanog上游5′-ATT TGC GGC CGC ATG AGT GTG GGT CTT C-3′，下游5′-CGG GAT CCT CAT ATT TCA CCT GGT GGA G-3′；Oct-4上游5′-AAG CTG CTG AAA CAG AAG AGG-3′，下游5′-ACA CGG TTC TCA ATG CTA GTC-3′。常規Trizol試劑提取A549、CD133+CD326+細胞總RNA，逆轉錄成cDNA及qRT-PCR操作均按照Takara試劑說明書操作。每個目的基因及內參做3個復孔。以GAPDH基因為內參基因，以CD133、CD326、Nanog、Oct-4作為目的基因，以A549細胞相對應的表達量為1，計算CD133+CD326+細胞中干性相關基因的表達相對于A549細胞的倍數關系，實驗重復3次。

1.2.4裸鼠成瘤實驗雄性裸鼠18只，分為6組，每組3只，分別注射A549細胞數目為1×104、1×105和1×106，注射CD133+CD326+細胞數目為1×103、1×104和1×105。選取對數生長期生長狀態良好且能傳代的A549及CD133+CD326+細胞，無菌PBS充分洗滌后計數細胞數目，于小鼠右下背部皮下注射相對應數目的CD133+CD326+細胞及A549細胞，每只總體積為150 μL。隨后每3天觀察細胞成瘤情況。

1.2.5激光共聚焦檢測對miR-155的識別成像功能及熒光強度分析取對數生長期的A549、LCSCs種板于激光共聚焦專用培養皿內，參考本課題組前期研究文獻[5]方法，按照WCS∶WMB質量比為7∶1的比例將MB和CS混合，漩渦震蕩60 s，室溫靜置30 min，自組裝方法合成CS-mir-155 MB及CS-RS MB，miR-155 MB和RS MB的終濃度為200 nmol/L，37 ℃細胞培養箱內孵育120 min，無菌PBS充分漂洗后加入300 μL Hoechst 33342染細胞核，37 ℃ 20 min，漂洗后加入200 μL無菌PBS，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。拍照后，每個培養皿內加入1 mL細胞裂解液，使細胞充分裂解。取96孔黑板，每組加入100 μL細胞裂解液，設置6個復孔，Varioskan Flash多功能酶標儀檢測各組Cy5的熒光強度。

1.2.6qRT-PCR驗證常規Trizol試劑提取A549、LCSCs總RNA， 逆轉錄成cDNA及qRT-PCR操作均按照Takara試劑說明書操作。每個目的基因及內參做3個復孔。以U6基因為內參基因，以miR-155作為目的基因，以A549細胞miR-155表達量為1，計算LCSCs中miR-155的表達相對于A549細胞的倍數關系，實驗重復3次。

2結果

2.1A549及CD133+CD326+細胞形態學觀察倒置顯微鏡下觀察到普通A549細胞為貼壁生長狀態，細胞形態為多角形、梭形。分選的CD133+CD326+細胞在干細胞培養基中培養后成球形生長，每個細胞球可見到由幾個到幾十個細胞融合而成球，細胞膜圓整，細胞質折光度較好，見圖1。

A：A549細胞；B：CD133+CD326+細胞。

圖1A549細胞及CD133+CD326+細胞形態學觀察(×200)

圖2免疫熒光檢測CD133+CD326+細胞中CD133和CD326的表達(×400)

2.2免疫熒光結果分選的成球干細胞既有表達CD133的綠色熒光信號，又有表達CD326的紅色熒光信號，二者在細胞膜和細胞質都有表達，藍色表示細胞核染色，見圖2。

2.3干性基因檢測結果成球生長的CD133+CD326+細胞高表達干性基因CD133、CD326、OCT-4和Nanog，為普通A549細胞的3.27、3.39、6.01、3.42倍，差異具有統計學意義(P<0.05)，分選的CD133+CD326+細胞具有干細胞特性，見圖3。

*:P<0.05，與A549細胞比較。

圖3qRT-PCR檢測A549及CD133+CD326+細胞中干性基因的表達

2.4裸鼠成瘤實驗在注射皮下腫瘤細胞15 d后可看到皮下移植瘤的產生。CD133+CD326+細胞在細胞數為1×105的數量下可以成瘤，進一步降低細胞數目為1×104數量下仍具備成瘤能力，1×103數量下細胞未能成瘤；而A549細胞能夠成功致瘤所需細胞數目為1×106，見表1。

表1　裸鼠皮下移植瘤成瘤實驗

2.5miR-155MB對miR-155的識別成像功能檢測及qRT-PCR驗證在有miR-155 MB存在的條件下，各組細胞均可檢測到較強的紅色熒光信號，大部分定位在細胞質，少數定位在細胞核，其中LCSCs紅色熒光強度最強。而在陰性對照CS-RS MB中未檢測到明顯紅色熒光信號，見圖4A。 A549、LCSCs在CS轉染miR-155 MB平均熒光強度分別為27.78和64.64，比較差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖4B。qRT-PCR檢測發現A549、LCSCs中均有miR-155的表達，LCSCs的miR-155的表達是A549細胞的2.63倍，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖4C。在熒光強度分析中，LCSCs中miR-155的表達是A549細胞的2.33倍，熒光強弱趨勢與qRT-PCR中miR-155的表達趨勢較一致。

A：激光共聚焦檢測對miR-155的識別并成像(×800)；B：熒光強度分析；C：qRT-PCR檢測。*：P<0.05,與A549細胞比較。

圖4成像后熒光強度分析及qRT-PCR檢測miR-155的表達

3討論

目前我國肺癌發病率和病死率均居腫瘤首位，大多數患者確診時已屬ⅢB或Ⅳ期，失去了手術機會，5年生存率低于20%[6]。肺癌的早期診斷可以使患者能夠在早期得到合理地診治，大大降低治療成本及病死率，因此尋求早期診斷的生物學標志物是提高患者存活率的關鍵，也是當今肺癌研究的重要任務。

現有研究表明腫瘤干細胞是所有腫瘤產生、發展、復發的根源，研究發現多種實體瘤組織及腫瘤患者血液中存在著腫瘤干細胞，這些腫瘤干細胞是腫瘤發生、發展、浸潤、轉移和復發的根源[7]。因此尋找肺癌干細胞有可能成為早期診斷一個新的突破點，為肺癌的早期診斷提供新方法[8]。如果能夠直接攜帶熒光物質靶定肺癌干細胞，將有望達到早期診斷肺癌的目的。

CD133已被研究證實可以作為大多數實體腫瘤干細胞分離和鑒定的通用分子標記物，其主要特點是在干細胞樣細胞中高表達，而在完全分化細胞中幾乎不表達；但也有研究認為把CD133作為肺癌干細胞的分子標記并不確切，需要聯合其他標記才有助于肺癌干細胞的檢測，肺癌、結腸癌、乳腺癌等腫瘤干細胞中也高表達CD326分子，這些細胞特別容易引發腫瘤[9-10]。因此，本研究基于以上研究背景，根據本課題組前期采用對A549細胞逆向誘導及紫杉醇富集的方法，從A549細胞系中分選出CD133+CD326+細胞，發現其在干細胞培養基中呈球形，懸浮生長。通過免疫熒光檢測懸浮的成球細胞均有CD133和CD326的表達，為CD133+CD326+細胞。qRT-PCR結果表明CD133+CD326+細胞高表達干細胞相關基因Oct-4、Nanog、CD133、CD326，且較普通A549細胞表達高。裸鼠成瘤實驗表明CD133+CD326+細胞致瘤能力更強，具有干細胞的特征。

miRNA是一類內源性、單鏈非編碼小分子RNA，通過調控信號通路對腫瘤細胞的發生、增殖、凋亡、侵襲等重要生物學過程發揮作用[11]。miR-155是miRNA中常見的一種小分子RNA，與腫瘤的增殖、凋亡、轉移、不良預后等密切相關[12]?，F有研究表明，miR-155在肺癌組織中顯著高表達，檢測肺組織內的miR-155表達水平能區分肺癌患者與非肺癌患者，而且肺癌組織中miR-155高表達的患者，其生存期更短[13]。表明肺癌細胞或肺癌干細胞中高表達的miR-155分子有可能成為肺癌早期診斷的分子靶標。本研究也發現miR-155在分選的CD133+CD326+肺癌干細胞中高表達。

MB是一個非常敏感的檢測DNA、RNA和miRNA的方法，為通過識別基因分子并成像腫瘤細胞提供了可能。殼聚糖為一種天然陽離子多糖，而基因分子本身帶有負電荷，二者可以通過靜電作用自組裝方式形成核殼結構，并被廣泛用于介導質粒、siRNA等基因轉染，CS已作為理想的基因載體廣泛應用于細胞和動物水平實驗[14]。因此，本研究利用CS作為miR-155 MB載體，激光共聚焦檢測表明在有miR-155 MB存在的條件下，A549、LCSCs中可檢測到較強的紅色熒光信號，且以LCSCs紅色熒光強度最強，而陰性對照RS MB未檢測到明顯紅色熒光信號。熒光強度分析表明以肺癌干細胞中熒光信號最強，同時通過qRT-PCR進一步檢測表明用CS轉染MB后的熒光強弱趨勢與qRT-PCR中miR-155的表達趨勢較一致，表明可以利用miR-155 MB通過檢測細胞高表達的miR-155并成像肺癌干細胞，可以有效地達到識別腫瘤干細胞的目的，從而為肺癌的早期診斷提供新思路、新方法。

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doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.003

*基金項目：國家高技術發展研究計劃“863”項目(2007AA02Zl29)；國家自然科學基金面上項目(81071786)。

作者簡介：朱海振(1984-)，住院醫師，博士，主要從事腫瘤干細胞、miRNA研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：tssh18018@126.com；▲ 共同通訊作者，E-mail：czt05@163.com。

[中圖分類號]R734.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)15-2036-04

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-01-21)

Using molecular beacon for detecting microRNA and imaging lung cancer stem cells research*

Zhu Haizhen1,Geng Tao1,Li Xuetao2,Lin Sheng3,Han Jing2,Jiang Feilong2,ChenGuangpeng2,TanShisheng1△,ChenZhengtang2▲

(1.DepartmentofOncology,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China;2.InstituteofCancer,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China;3.DepartmentofOncology,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

[Abstract]ObjectiveTo detect the miR-155 in the CD133+ CD326+ cells(LCSCs) and imaging them by using the miR-155 molecular beacon (MB).MethodsA549 cells were cultured in the serum-free stem cell medium and treated by paclitaxel until new spheroids emerged;then we sorted the CD133+ CD326+ cells by flow cytometry and identified their stem characteristics.Chitosan nanoparticles(CS) were adopted to deliver the miR-155 MB.The laser confocal microscopy was used to detect and image the miR-155 in LCSCs.The miR-155 expression level was verified by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR).ResultsThe LCSCs formed the sphere in stem cell culture medium,the stem genes (CD133,CD326,OCT-4,Nanog) expression levels were 3.27，3.39，6.01，3.42 times higher than those of A549 cells(P<0.05).1×104 cells formed the subcutaneous transplanted tumors.The red fluorescence was detected in the A549 and LCSCs when CS transfect the miR155 MB,and the fluorescent signal of LCSCs was the highest(P<0.05).The fluorescence intensity was proximately consistent with the level of miR-155 expression determined by qRT-PCR.ConclusionUsing the miR-155 MB could detect the miR-155 in the LCSCs and image them.It might be a new idea for monitoring the lung cancer stem cell.

[Key words]neoplastic stem cell；lung neoplasms；A549;molecular beacon