Piezo2蛋白的生物信息學分析及其在腸道中的表達*

白　濤，錢　偉，汪　歡，張　磊，宋　軍，侯曉華

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院消化內科，武漢 430022)

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Piezo2蛋白的生物信息學分析及其在腸道中的表達*

白濤，錢偉，汪歡，張磊，宋軍△，侯曉華

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院消化內科，武漢 430022)

[摘要]目的對Piezo2性質、結構和功能進行預測分析，并檢測其在腸道的表達。方法利用Protparam程序預測人Piezo2蛋白基本理化性質；TMHMM Serve 2.0預測跨膜結構域；ProtComp Version 9.0分析亞細胞定位；用SOPMA程序預測其二級結構；SWISS-MODEL服務器生成其三維模型。免疫組織化學染色確定Piezo2在腸道組織的表達位置，以實時定量熒光PCR檢測Piezo2在不同腸段的表達量及與Epac1表達的相關性。結果Piezo2蛋白分子式為C14539H22436N3662O4087S130，相對分子質量為318.092×103，等電點pI=5.82。Piezo2蛋白存在35個跨膜結構域，并有多個蛋白修飾位點。免疫組織化學染色發現Piezo2蛋白表達于腸道上皮與神經節，其在結腸表達水平較回腸豐富(P<0.01)，其中結腸Piezo2與Epac1在mRNA水平表達呈正相關(r2=0.65，P<0.01)。結論Piezo2在結腸表達豐富，可能通過Epac1通路參與腸道機械力感知與調控。

[關鍵詞]腸神經系統；腸黏膜；機械門控離子通道；Piezo2

2010年Coste等[1]發現并定義了Piezo2蛋白。通過細胞系中的體外siRNA篩選及電生理實驗的方法，證實Piezo2是機械門控離子通道蛋白。Piezo2是非選擇性陽離子通道蛋白，受機械信號刺激，通道開放，將機械刺激信號轉化為生物電信號。Piezo2表達于傳入神經節(如三叉神經節及背根神經節)、梅克爾細胞、肺、膀胱等組織。在生物機體感受機械刺激過程中有重要作用。有關機械刺激的感知的細胞學及分子生物學機制研究尚不清楚，Piezo2蛋白的發現和研究具有重要意義。本文通過生物信息學預測Piezo2蛋白理化性質、蛋白結構、生物學功能，同時檢測其在腸道組織中的表達及定位，推測Piezo2蛋白在腸道感知機械刺激信號中可能有重要作用，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料人Piezo2蛋白的基因及其編碼蛋白的GenBank登錄號依次為JN790819與AFC88283。多克隆抗體Piezo2購自Abcam公司；二抗購自武漢博士德公司；Trizol購自Gibco公司；PCR引物由上海英俊生物有限公司合成；逆轉錄酶試劑盒購自TAKARA公司；NIH小鼠購自廣東省實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1生物信息學方法利用Protparam在線程序預測人Piezo1蛋白基本理化性質[2]，如相對分子質量、等電點、平均疏水系數等；利用在線系統TMHMM Serve 2.0預測跨膜結構域[3]；利用ProtComp Version 9.0在線工具分析亞細胞定位；利用SOPMA在線程序預測其二級結構[4]；利用SWISS-MODEL服務器生成其三維模型[5]，并在PyMOL Version 1.7.4中編輯。

1.2.2實驗室方法4%多聚甲醛固定組織標本24 h后，石蠟包埋。一抗工作濃度為1∶250，4 ℃過夜。二抗為熒光素標記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)，中性樹膠封片。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗做陰性對照。使用Trizol提取組織RNA(步驟按照產品說明書)，運用逆轉錄試劑盒使RNA逆轉錄為cDNA，應用SYBRGreen和實時定量熒光PCR(Real-time PCR)檢測儀檢測Piezo2的mRNA水平。引物如下，β-actin：上游5′-TGT TAC CAA CTG GGA CGA CA-3′，下游5′-CTG GGT CAT CTT TTC ACG GT-3′；Piezo2：上游5′-GTG GTA TGC AAC CCA GTA CCC-3′，下游5′-GGC CAT TCT CTA TGG GCA GG-3′；Epac1：上游5′-GTG TTG GTG AAG GTC AAT TCT G-3′，下游5′-CCA CAC CAC GGG CAT C-3′。

1.3統計學處理采用R2.11.1軟件，使用t檢驗和Pearson相關性檢驗方法進行統計分析，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1人Piezo2蛋白基本理化性質預測通過Protparam預測Piezo1蛋白基本理化性質，推測蛋白分子式為C14539H22436N3662O4087S130，相對分子質量為318.092×103，等電點pI=5.82，波長280 nm時摩爾消光系數為505 380，半衰期為30 h，平均疏水性系數為-0.086，脂肪系數93.51。不穩定參數為50.26，屬不穩定蛋白。Piezo1蛋白所含氨基酸殘基數為2 752，其中堿性殘基數目為300，酸性殘基數為343。所含氨基酸組成為：氨基酸Ala(5.3%)、Arg(4.6%)、Asn(3.3%)、Asp(4.1%)、Cys(1.8%)、Gln(3.6%)、Glu(8.3%)、Gly(4.7%)、His(2.0%)、Ile(7.4%)、Leu(10.7%)、Lys(6.3%)、Met(2.9%)、Phe(6.0%)、Pro(4.0)、Ser(7.7%)、Thr(4.9%)、Trp(2.2%)、Tyr(4.1%)、Val(6.1%)，含Leu和Glu最多，不含Pyl和Sec。

2.2人Piezo2蛋白跨膜結構域、亞細胞定位及翻譯后修飾位點分析利用在線系統TMHMM Serve 2.0對Piezo2蛋白進行跨膜結構域預測分析，結果見圖1。人Piezo2蛋白存在35個跨膜結構域，編號位置分別為10-41、62-84、122-144、214-236、241-260、267-289、504-526、539-561、581-598、678-700、704-726、733-755、787-809、932-954、959-976、981-1003、1052-1074、1113-1135、1139-1156、1169-1191、1217-1239、1291-1310、1314-1336、1349-1371、1909-1931、1936-1955、1965-1987、2189-2211、2231-2253、2260-2282、2292-2314、2327-2344、2359-2378、2399-2421、2660-2682。使用ProtComp Version 9.0在線工具分析Piezo2蛋白亞細胞定位，結果顯示存在于細胞膜、高爾基體、內質網等生物膜結構中。使用MotifyScan進行翻譯后修飾位點分析，預測人Piezo2蛋白理論上存在4個酰胺化位點(382-385、1529-1532、2062-2065、2139-2142)，16個N-糖基化位點(95-98、765-768、1009-1012、1013-1016、1020-1023、1030-1033、1085-1088、1713-1716、2114-2117、2125-2128、2525-2528、2539-2542、2559-2562、2572-2575、2622-2625、2634-2637)，8個cAMP-和cGMP-依賴性蛋白激酶磷酸化位點(384-387、1048-1051、1601-1604、1613-1616、1632-1635、2064-2067、2096-2099、2284-2287)，32個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(97-100、155-158、366-369、405-408、477-480、783-786、823-826、838-841、886-889、896-899、954-957、1203-1206、1284-1287、1515-1518、1556-1559、1604-1607、1718-1721、1722-1725、1767-1770、1782-1785、1795-1798、1810-1813、1819-1822、1844-1847、1857-1860、1861-1864、1879-1882、2054-2057、2086-2089、2101-2104、2223-2226、2495-2498)，19個豆蔻酰化位點(113-118、128-133、216-221、414-419、620-625、761-766、1046-1051、1106-1111、1123-1128、1201-1206、1695-1700、1728-1733、1763-1768、1800-1805、2119-2124、2320-2325、2501-2506、2672-2677、2691-2696)，31個蛋白激酶C磷酸化位點(56-58、102-104、110-112、195-197、321-323、459-461、483-485、871-873、954-956、1004-1006、1310-1312、1358-1360、1390-1392、1604-1606、1863-1865、1897-1899、1961-1963、2070-2072、2106-2108、2113-2115、2116-2118、2122-2124、2127-2129、2135-2137、2160-2162、2282-2284、2384-2386、2550-2552、2561-2563、2576-2578、2623-2625)，2個酪氨酸激酶磷酸化位點(1790-1797、2382-2388)。

圖1　Piezo2蛋白進行跨膜結構域預測分析

A：預測模型1；B：預測模型2；C：預測模型3。

圖2人Piezo2蛋白三級結構

2.3人Piezo2蛋白二級、三級結構及功能預測SOPMA在線程序分析結果顯示，人Piezo2蛋白含2 752個氨基酸，其中1 301個(47.27%)氨基酸可能形成α螺旋，537個(19.51%)氨基酸形成延伸鏈，204個(7.41%)氨基酸形成β轉角，710個(25.80%)氨基酸形成無規則卷曲。通過SWISS-MODEL服務器生成三維模型，在PyMOL Version 1.7.4中進行結構編輯，生成人Piezo2蛋白三維模型如圖2。

2.4Piezo2蛋白在腸道中的表達Piezo2表達于上皮與腸神經系統，Piezo2蛋白在小鼠結腸組織中表達見圖3。

2.5Piezo2蛋白在小鼠腸道表達差異Real-time PCR檢測小鼠不同腸段Piezo2與Epac1 mRNA表達情況，結腸Piezo2及Epac1表達較小腸豐富(P<0.01)，見圖4A、B；結腸Piezo2與Epac1在mRNA水平表達呈正相關(r2=0.65，P<0.01)，而在小腸未檢測出相關性，見圖4C、D。

圖3　Piezo2蛋白在結腸中的表達(SABC，×400)

A：不同腸段Piezo2表達；B：不同腸段Epac1表達；C：小腸Piezo2與Epac1表達；D：結腸Piezo2與Epac1表達。

圖4不同腸段Piezo2與Epac1 mRNA表達情況

3討論

Piezo2是重要的機械敏感離子通道蛋白，在機械刺激感知中有重要作用。已有研究發現，Piezo2表達于初級傳入神經(三叉神經節、背根神經節)，參與其機械信號感知，在背根神經節中干擾Piezo2表達可以調節細胞的感覺閾值[6-9]。Piezo2在梅克爾細胞中表達，在皮膚感受觸覺中有重要作用[10-12]。此外，Piezo2在DRG中與傷害感受器共表達，提示了感受機械傷害性刺激的重要分子機制[13]。Piezo2的突變與神經肌肉功能異常的疾病相關，在遠端關節攣縮、戈登綜合征及馬丹沃克綜合征中發現了Piezo2的突變，提示Piezo2在調節神經及運動功能中有重要作用[14-15]。

本文運用生物信息學工具預測Piezo2蛋白理化性質、結構及相關功能。Piezo2具有超過2 500氨基酸殘基，是多次穿膜的大分子蛋白。其中α螺旋(47.27%)比例較大，有利于穿膜結構的穩定，無規則卷曲(25.80%)存在一定比例，并可能成為蛋白質功能調節和修飾位點的存在位置。翻譯后修飾位點預測發現，在Piezo2蛋白中，具備多個重要修飾位點，其修飾位點功能的研究有待于進一步研究。本研究通過實驗室方法證實，Piezo2在腸神經系統中表達，結腸水平表達較回腸豐富，且表達在結腸與Epac1相關。腸神經系統有“腸腦”之稱，在腸道感知腸腔刺激、調節腸道內環境穩態、調節腸道動力等過程中有重要作用。Piezo2可能在腸道感知機械刺激中有重要功能，Epac1通路同樣可能參與Piezo2功能調控[8,16]。

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doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.004

*基金項目：國家自然科學基金資助項目(81200271)。

作者簡介：白濤(1989-)，在讀博士，主要從事胃腸功能性疾病研究。△通訊作者，E-mail：song111jun@126.com。

[中圖分類號]R574.6

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)15-2040-03

(收稿日期：2015-11-14修回日期：2016-01-08)

Bioinformatics analysis of Piezo2 and its expression detection in the gut*

Bai Tao，Qian Wei，Wang Huan，Zhang Lei，Song Jun△，Hou Xiaohua

(DepartmentofGastroenterology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei430022,China)

[Abstract]ObjectiveTo predict and analysis the physical and chemical properties as well as the structure and function of Piezo2,and to detect the expression of Piezo2 in gut.MethodsPhysical and chemical properties of Piezo2 were predicted with Protparam.Transmembrane domain was predicted with TMHMM Serve 2.0.Subcellular location was analyzed with ProtComp Version 9.0.Protein secondary structure was predicted with SOPMA program.Three-dimensional model was created with SWISS-MODEL.Location of Piezo2 in intestine was analyzed with immunohistochemical staining and RT-PCR was performed to compare the expression in different segment of intestine and correlation to Epac1.ResultsMolecular formula of Piezo2 was C14539H22436N3662O4087S130with molecular weight of 318.092×103 and isoelectric point of 5.82.Piezo2 had 35 transmembrane domains and many post-translational modification sites.Piezo2 existed in intestinal epithilial tissue and ganglion cells.Expression of Piezo2 in colon was much more abundant than that in small intestine(P<0.01) and positive correlated to Epac1 (r2=0.65，P<0.01).ConclusionColon is rich in Piezo2.Piezo2 might play a key role in function regulation of intestinal epithelium and enteric nervous system by Epac1 pathway.

[Key words]enteric nervous system；intestinal mucosa；mechanically gated ion channels;Piezo2