半乳糖凝集素-3聯合HGF誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為肝樣細胞*

吳增城，康利民,2，李　陽，郭　斌，馮　磊，彭　青，潘明新△

(1.南方醫科大學珠江醫院肝膽二科/“器官衰竭防治”國家重點實驗室/“器官衰竭防治”協同創新中心/廣東省人工器官與組織工程研究中心，廣州 510282；2.云南省普洱市人民醫院肝膽外科　665000)

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半乳糖凝集素-3聯合HGF誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為肝樣細胞*

吳增城1，康利民1,2，李陽1，郭斌1，馮磊1，彭青1，潘明新1△

(1.南方醫科大學珠江醫院肝膽二科/“器官衰竭防治”國家重點實驗室/“器官衰竭防治”協同創新中心/廣東省人工器官與組織工程研究中心，廣州 510282；2.云南省普洱市人民醫院肝膽外科665000)

[摘要]目的探索半乳糖凝集素-3(Gal-3)聯合肝細胞生長因子(HGF)誘導大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)向肝樣細胞分化的可行性及最佳誘導條件，并對誘導后的細胞進行鑒定。方法離心、貼壁培養分離大鼠BMSCs，流式細胞術鑒定表面標志。取第3代細胞進行分組誘導培養，A組：0 μg/mL Gal-3+20 ng/mL肝細胞生長因子(HGF)；B組：0.1 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF；C組：0.5 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF；D組：1.0 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF；E組：2.0 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF；陽性對照組：SD大鼠肝臟細胞IAR20。分別于誘導后7、14、21、28 d時段進行細胞形態學觀察、免疫熒光染色檢測、實時熒光定量核酸擴增檢測(Q-PCR)鑒定其誘導分化情況。結果分組誘導培養后，各組BMSCs形態逐漸向肝樣細胞轉化，與大鼠原代肝臟細胞IAR20相似，其中28 d時間段，C組轉化成IAR20相似細胞比例最高；各組甲胎蛋白(AFP)、清蛋白(ALB) 熒光染色陽性率明顯增高，并且在28 d時間點C組AFP、ALB的熒光染色陽性率最高；C組AFP、ALB mRNA表達明顯增加，同時以28 d時間點表達量達到峰值。結論Gal-3聯合HGF能有效誘導大鼠BMSCs分化為肝樣細胞，分化后的肝樣細胞能分泌肝細胞特異性產物AFP、ALB，且其誘導效率與誘導培養時間和Gal-3濃度有關。

[關鍵詞]間質干細胞；甲胎蛋白類；肝細胞生長因子；骨髓間充質干細胞；半乳糖凝集素-3；誘導；肝樣分化

骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類具有自我復制功能和多向分化潛能的成體干細胞[1]，在一定條件下可以誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、心肌細胞，以及肝細胞等[2-6]。由于其可以定向分化為肝樣細胞，參與肝臟的損傷修復、細胞更新、功能重建等病理生理過程[7]，在肝病治療中的具有巨大應用潛能。半乳糖凝集素-3(Gal-3)是半乳糖凝集素家族中的一員，參與多種生理和病理過程，包括細胞生長、增殖、凋亡、分化、炎性反應及新生血管形成和腫瘤浸潤與轉移等[8]。有研究發現Gal-3在缺血性腦組織中神經元再生和血管內皮細胞的增殖分化過程中起重要作用[9-10]。但尚不明確其在BMSCs向肝樣細胞轉化過程中的作用。因此本研究通過將不同濃度的Gal-3聯合肝細胞生長因子(HGF)加入BMSCs培養液中誘導培養BMSCs向肝樣細胞定向分化，以探索該方法的可行性及相關條件。

1材料與方法

1.1材料健康SD雄性大鼠，體質量80～100 g，由南方醫科大學實驗動物中心供應。大鼠肝臟細胞IAR20購自上海一研生物；Murine HGF、Human Gal-3購自peprotech公司；胎牛血清、DMEM-F12培養基、青鏈霉素、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)均購自Hyclone公司；抗大鼠CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD90-FITC購自eBioscience公司，抗大鼠CD45及羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)熒光二抗購自Bioss公司；兔抗大鼠甲胎蛋白(AFP)單克隆一抗購自Abcam公司，兔抗大鼠清蛋白(ALB)單克隆一抗購自Santa公司。

1.2方法

1.2.1大鼠BMSCs的分離、培養及鑒定SD大鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下提取股骨、脛骨骨髓液，采用Percol 1液分離獲取細胞，以5×106/mL接種于50 mL塑料培養瓶中，置于37 ℃，5% CO2的培養箱內培養。48 h首次換液，去除未貼壁的細胞，以后每隔 2～3天換液1次。直至細胞長滿至80%～90%，按1∶3傳代。取P3細胞，制備單細胞懸液(5萬～10萬)，分別加入抗大鼠CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD90-FITC、CD45，避光孵育30 min，PBS沖洗離心，重懸細胞后上流式細胞儀。其中CD45培養瓶需要在孵育結束后加入二抗繼續孵30 min。

1.2.2實驗分組及誘導分化培養取生長狀態良好的P3代細胞，根據SD大鼠BMSCs完全培養基加入不同濃度Gal-3分組。A組：0 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF；B組：0.1 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF；C組：0.5 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF；D組：1.0 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF；E組：2.0 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF；陽性對照組：SD大鼠肝臟細胞IAR20。

1.2.3細胞形態學觀察各組在誘導后第7、14、21、28天倒置顯微鏡觀察細胞形態學變化。

1.2.5細胞免疫熒光染色分別于誘導后第7、14、21、28天收集細胞，制備爬片，行免疫熒光細胞化學染色。一抗為兔抗鼠ALB(1∶400)、AFP(1∶320)，以IAR20細胞為陽性對照。熒光顯微鏡觀察拍照。

2結果

2.1大鼠BMSCs分離培養及流式鑒定結果分離培養的BMSCs呈集落、漩渦狀生長，外觀呈長梭形，有偽足(圖1)。流式細胞術檢測結果顯示間充質干細胞標記分子CD29、CD44和CD90陽性，造血系干細胞標記分子CD34和CD45為陰性，見圖2。

A：漩渦狀生長；B：長梭形。

圖1SD大鼠BMSCs形態觀察(×100)

2.2誘導后細胞形態學觀察結果分組誘導培養7 d后，部分細胞偽足變短，呈短梭形改變；誘導培養14～21 d后，變成紡錘、不規則圓形或多角形，細胞變平變薄，部分細胞開始小范圍的呈島狀連接；培養至28 d時，細胞類似肝細胞樣，形成島狀連接成片，可見許多雙核細胞和多核細胞，與大鼠原代肝臟細胞IAR20相似。其中以C組轉化成IAR20相似細胞比例最高，見圖3。B、D、E組細胞形態變化程度居于A、C組間，因此不單列圖做說明。

圖2　流式細胞術檢測BMSCs表面標記分子

2.3Q-PCR檢測AFP、ALB mRNA表達結果取相對定量的方法檢測目的基因的表達變化，按照2-ΔΔCT法對數據進行統計分析。結果顯示不同濃度的Gal-3+HGF組與誘導培養時間對于AFP、ALB的mRNA 表達存在交互效應(P<0.01)。隨著時間的延長，7、14、21及28 d 4個時間段 AFP、ALB的mRNA表達差異有統計學意義(P<0.01)；同時不同濃度的Gal-3聯合HGF誘導骨髓干細胞表達AFP、ALB差異有統計學意義(P<0.01)。本研究還發現與陽性對照組比較，隨著培養時間的延長，C組AFP、ALB mRNA表達明顯增加，28 d時，C組AFP、ALB的mRNA表達量最高，見表1～2、圖4～5。

2.4細胞免疫熒光染色結果與陽性對照組比較，隨著培養時間的延長，各組AFP及ALB 熒光染色陽性率明顯增高，同時以28 d時間點各組染色陽性率最高；并且在28 d時間點各組比較發現，C組AFP及ALB的熒光染色陽性率最高，見圖4、5。B、D、E組AFP、ALB的免疫熒光染色大致等同于C組，但陽性率低于C組，因此不單列圖做說明。

A:A組誘導培養后28 d；B：C組誘導培養后28 d；C：陽性對照組。

圖3　誘導培養后細胞形態學變化(×100)

a：主效應的F統計量和P值；b：交互效應的F統計量和P值。c：P<0.05，與陽性對照組比較。

表2　不同時段 ALB Q-PCR 2-ΔΔCT值

a：主效應的F統計量和P值；b：交互效應的F統計量和P值。c：P<0.05，與陽性對照組比較。

A:A組誘導培養后28 d；B：C組誘導培養后28 d；C：陽性對照組。

圖4誘導BMSCs培養28 d AFP熒光染色(×200)

A:A組誘導培養后28 d；B：C組誘導培養后28 d；C：陽性對照組。

圖5誘導BMSCs培養28 d ALB熒光染色(×200)

3討論

原位肝移植作為治療各種終末期肝病的方法存在供體短缺、免疫排斥、費用昂貴等各種限制，干細胞移植由于其治療操作簡單，可重復進行，免疫源性弱，治療費用低等優點在肝臟疾病替代治療領域和組織工程領域存在重要研究價值[11]。BMSCs是存在于骨髓的有多向分化潛能的成體干細胞，具有供源豐富，易于獲得，有自體供源，避免免疫排斥等優點，成為干細胞移植治療的理想種子細胞[12]。本實驗采用貼壁培養法分離提純大鼠BMSCs，流式細胞術鑒定結果顯示其高表達間充質干細胞標志CD29、CD44和CD90，不表達造血干細胞標志CD34和CD45[13]，為后續實驗提供純度高、活性好的細胞來源，有利于誘導培養進行。

目前，體內外誘導BMSCs向肝樣細胞定向分化并具有肝細胞的合成和分泌功能的研究很多[14]，如何高效獲得大量功能性肝樣細胞是BMSCs體外研究的努力方向。現有研究發現在BMSCs向肝樣細胞誘導分化過程中起重要作用的生長因子和細胞因子很多，其中應用最為廣泛的是HGF。HGF主要在肝臟枯否細胞與肝竇內皮細胞中產生，當其濃度小至1 ng/mL時，對肝細胞就有促進有絲分裂作用，是正常肝細胞最強的促有絲分裂劑。Okumoto等[15]將HGF作為誘導因子誘導大鼠BMSCs分化，21 d后細胞增殖形成克隆，表達所有肝細胞特異性基因。此外，細胞因子的種類、濃度、作用時間和作用時段等都會影響BMSCs的分化、增殖甚至分化后細胞的生物學特性。由于肝損傷時肝細胞再生修復過程中其微環境中的影響是多因素的，而HGF在肝損傷微環境中的變化又是最突出的，本實驗選擇采用20 ng/mL HGF作為基礎誘導劑，不僅提高分化效率，便于本研究對誘導效果的觀察研究，更能體現肝細胞再生修復過程中復雜的影響因素。

Gal-3是一種具有獨特的嵌合體結構的β-半乳糖苷結合蛋白，主要定位于細胞質，也見于細胞核、細胞表面和細胞外環境，其功能多樣性[16]，通過其糖識別域(CRD)與細胞表面的糖蛋白或糖脂結合，參與多種生理和病理過程，包括細胞生長、增殖和凋亡、細胞黏附及血管形成和腫瘤浸潤與轉移等。Gal-3在促進多種細胞的再生和修復中起重要的作用[8]。有研究發現在體外實驗中，劑量依存性的Gal-3可以刺激BMSCs向血管內皮細胞分化，且10 mg/L濃度的Gal-3誘導效果最明顯[10]。Gal-3和肝細胞再生修復的關系也很密切。Yamazaki等[17]以四氯化碳(CCl4)肝損傷大鼠模型為研究對象，發現在肝臟修復過程中Gal-3通過激活酪氨酸激酶信號通路而促進肝臟細胞的增殖。楊永峰等[18]的研究提示急性肝衰竭時患者體內的Gal-3水平與患者的臨床預后密切相關。Ulu等[19]發現在肝癌和病毒性肝炎肝損傷患者血清中Gal-3水平明顯升高。鑒于Gal-3與干細胞分化和肝細胞再生修復有密切相關性，本研究推測Gal-3可能通過誘導BMSCs定向分化為肝樣細胞從而修復損傷的肝功能，而且其誘導效率同樣存在劑量依賴性和時間依從性。為了驗證這一假說，本研究采用不同濃度的Gal-3聯合HGF誘導BMSCs向肝樣細胞轉化。實驗結果顯示，不同濃度的Gal-3聯合HGF均能誘導BMSCs定向分化為肝樣細胞，而且誘導得到的細胞能表達肝細胞特異性產物ALB和AFP，其中0.5 μg/mL Gal-3聯合20 ng/mL HGF劑量組進行28 d培養后誘導效率最高。相對于單獨使用HGF進行誘導培養，加入Gal-3后誘導效率明顯提高，分化后的細胞功能及活性也明顯增強。

實驗結果還發現了0.5 μg/mL濃度條件下Gal-3的誘導作用最強，為下一步探索單獨使用Gal-3能否高效的誘導大鼠BMSCs向肝樣細胞分化及其與20 ng/mL HGF誘導分化作用差異比較等問題奠定了實驗條件和基礎。

綜上所述，Gal-3是一個非常有潛力的強有力的促進BMSCs向肝樣細胞分化的因子，0.5 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF能高效誘導大鼠BMSCs定向分化為肝樣細胞。但是Gal-3能否單獨起到誘導作用及其與經典誘導劑HGF的誘導分化作用差異，以及其是通過何種機制促使BMSCs的誘導分化等問題還需要進一步的實驗探索研究。

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doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.005

*基金項目：國家高技術發展研究計劃“863”項目(2012AA020505)；廣東省自然科學基金項目(2014A030313279)；廣東省省級科技計劃項目(2014B020227002)。

作者簡介：吳增城(1989-)，住院醫師，在讀碩士，主要從事肝組織損傷修復研究。△通訊作者，E-mail:pmxwxy@sohu.com。

[中圖分類號]Q254

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)15-2043-05

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-02-01)

Gal-3 united HGF induce the differentiation of rats BMSCs into hepatocyte-like cells*

Wu Zengcheng1,Kang Liming1,2,Li Yang1,2,Guo Bin1,Feng Lei1,Peng Qing1,Pan Mingxin1△

(1.SecondDepartmentofHepatobiliarySurgery,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity/StateKeyLaboratoryofOrganFailureResearch/Co-InnovationCenterforOrganFailureResearch/GuangdongProvincialResearchCenterofArtificialOrganandTissueEngineering,Guangzhou,Guangdong510282,China;2.DepartmentofHepatobiliangSurgery,PuerPeople′sHospital,Puer,Yunnan665000,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the feasibility and optimum concentration of direct differentiation of rats BMSCs into hepatocyte-like cells induced by Gal-3 joint HGF and identify the induced cells.MethodsRats BMSCs were separated used gradient centrifugation and adherence culture,and then identified by flow cytometry.The third generation cells were divided into 5 groups.Group A:0 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF;group B:0.1 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF;group C:0.5 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF;group D:1.0 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF;group E:2.0 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF;positive control group:primary rat hepatic cells IAR20.The morphology observation,Q-PCR and immunofluorescent staining were applied respectively after induced 7,14,21,28 d to identify the cells differentiation.ResultsAfter induction,the morphological characteristics gradually transformed into hepatocyte-like cells,similar to primary rat hepatic cells IAR20,the translation rate of group C in the 28-days time period was the highest;Immunohistochemical examination demonstrated that fluorescence staining positive rate of ALB and AFP in each group increased over induced time,and group C was the highest in the 28-days time period.Q-PCR demonstrated that the expression of ALB and AFP mRNA in group C increased over induced time,and peaked in the 28-days time period.ConclusionGal-3 joint HGF could induce the differentiation of rats BMSCs into hepatocyte-like cells which secrete hepatocyte specific product AFP and ALB,and the induction efficiency is related to the induction time and the concentration of Gal-3.

[Key words]mesenchymal stem cells；alpha-fetoproteins；hepatocyte growth factor；bone marrow-derived mesenchymal stem cells；Gal-3；induce;hepatocyte-like differentiation