Notch1-核轉錄因子κB在三陰乳腺癌組織中的表達及臨床意義*

覃舒婷，莫軍揚，張敏敏，唐　茜

(廣西壯族自治區柳州市人民醫院普外三科　545005)

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Notch1-核轉錄因子κB在三陰乳腺癌組織中的表達及臨床意義*

覃舒婷，莫軍揚，張敏敏，唐茜

(廣西壯族自治區柳州市人民醫院普外三科545005)

[摘要]目的探討Notch1-核轉錄因子κB(Notch1-NF κB)在三陰乳腺癌(TNBC)組織中的表達及臨床意義。方法收集2013年6月至2014年12月住院的TNBC患者(乳腺癌組，n=66)和乳腺良性腫瘤患者(良性腫瘤組，n=62)乳腺組織標本，免疫組織化學法和Western blot法檢測組織中Notch1-NF κB的表達。酶聯免疫吸附試驗法檢測不同病理學特征的TNBC患者乳腺組織中Notch1-NF κB水平。結果免疫組織化學顯示，Notch1-NF κB在乳腺癌組乳腺組織中呈高表達，在良性腫瘤組中呈微弱表達。Western blot示Notch1-NF κB在乳腺癌組中蛋白定量顯著高于良性腫瘤組(P<0.05)。66例TNBC乳腺組織病理學分級和TNM分期不同，Notch1-NF κB水平均有差異，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結論Notch1-NF κB在TNBC患者乳腺組織中高表達，其水平與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關。

[關鍵詞]乳腺腫瘤；免疫組織化學；轉錄因子；三陰乳腺癌；Notch1；核轉錄因子κB

Notch1是Notch基因編碼的蛋白家族成員之一，激活后可使正常細胞向惡性細胞轉化。多項研究表明Notch1影響了乳腺癌的形成和預后[1-2]。核轉錄因子κB(NF-κB)是一種具有多項調節功能的核轉錄因子，在細胞的增殖、分化和凋亡中起重要作用[3]，其活性受Notch信號通路的調控[2]。目前，已有研究發現抑制Notch1-NF κB活性可以降低三陰乳腺癌(triple-negative breast cancers，TNBC)細胞的生長速度[4]，但此項研究是在細胞株進行的，Notch1-NF κB在TNBC患者中的表達情況及臨床意義，國內外研究甚少。本研究通過檢測TNBC和乳腺良性腫瘤患者的乳腺組織中Notch1-NF κB表達及其與腫瘤分級、分期、淋巴結轉移的關系，分析Notch1-NF κB表達在TNBC中的臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2013年6月至2014年12月廣西柳州市第一人民醫院普外三科收治的TNBC患者66例為乳腺癌組，女性，年齡26～78歲，平均(48.6±12.9)歲。同期收治的良性乳腺腫物患者62例為良性腫瘤組，女性，年齡22～67歲，平均(43.1±9.2)歲。收集石蠟標本用于免疫組織化學，收集術中乳腺組織(取自病變非壞死部位，液氮速凍，-80 ℃保存)用于Western blot和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定。

1.2方法

1.2.1主要試劑兔抗人Notch1一抗和兔抗人NF-κB一抗購自美國Cell Signaling；BCA蛋白定量盒購自美國Thermo公司；Notch1和NF-κB水平檢測采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國R&D公司；羊抗兔二抗、多聚甲醛、石蠟、檸檬酸緩沖液和蘇木素購自北京中杉金橋生物技術公司；酶標儀產自芬蘭 Themo公司。

1.2.2試驗方法NF-κB是由一系列相關蛋白組成，最常見的NF-κB二聚體為p65/p50，磷酸化的p65(phospho-NF-κB p65)是p65的活性形式。因此，本試驗中均以phospho-NF-κB p65的檢測結果代表NF-κB水平。

1.2.2.1免疫組織化學檢測乳腺組織Notch1-NF κB表達采用免疫組織化學SP法檢測，具體步驟按照試劑盒說明書操作。細胞膜和(或)胞膜質和(或)細胞核出現黃色或棕黃色顆粒為陽性反應。

1.2.2.2Western blot檢測乳腺組織Notch1和phospho-NF-κB p65表達取約200 mg 組織剪碎，加入裂解液，冰上研磨，超聲波破碎，4 ℃離心，轉速10 000 r/min，時間20 min。BCA法蛋白定量，取60 μg蛋白與5×加樣緩沖液混勻，100 ℃變性5 min，冷卻后上樣。恒壓電泳2 h，4 ℃下將樣品轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，TBST洗滌3次，每次5 min。加入兔抗人Notch1一抗(1∶500)和 phospho-NF-κB p65一抗(1∶500)，4 ℃過夜，TBST洗滌3次，加入羊抗兔二抗(1∶3 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次。加入化學發光液顯色。

1.2.2.3ELISA檢測乳腺組織Notch1和NF-κB水平將凍存標本置于2～8 ℃，直至融化。加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，勻漿器將標本勻漿充分。離心20 min后收集上清液。BCA法蛋白定量后按照說明書操作，主要步驟為：加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、顯色、終止反應、測定吸光度。以標準物的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，根據標準曲線計算相應的濃度。

2結果

2.1兩組患者乳腺組織中Notch1和NF-κB表達差異在良性腫瘤組的乳腺組織中，Notch1和NF-κB均呈微弱表達(圖1A、C)，Notch1和NF-κB陽性表達率分別為21%和16%。而乳腺癌組患者的癌變組織中，可見棕褐色顆粒沉積于細胞膜和細胞質，呈Notch1高表達(圖1B)，陽性表達率79%；棕黃色顆粒沉積于細胞質和細胞核，呈NF-κB陽性表達(圖1D)，陽性表達率70%。Notch1和NF-κB在乳腺癌組織中表達的相關性：14例Notch1陰性表達病例中NF-κB陽性表達4例，52例Notch1陽性表達病例中NF-κB陽性表達39例，Spearman相關性分析顯示，Notchl與NF-κB呈顯著正相關(r=0.398，P=0.01)。

A：良性腫瘤組Notch1；B：乳腺癌組 Notch1；C：良性腫瘤組 phospho-NF-κB p65；D：乳腺癌組 phospho-NF-κB p65。

圖1Notch1和NF-κB在乳腺組織中的表達(免疫組織化學染色，×400)

2.2兩組患者乳腺組織中Notch1和NF-κB蛋白表達差異與良性腫瘤組比較，乳腺組患者乳腺組織Notch1蛋白和phospho-NF-κB p65表達顯著升高(P<0.05)，見圖2。

良性腫瘤組Notch1或NF-κB p65蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值設為1。A：Notch1在良性腫瘤和乳腺癌組織中的表達。B：phospho-NF-κB p65在良性腫瘤和乳腺癌組織中的表達。*：P<0.05，與良性乳腺癌組比較。

圖2Notch1和phospho-NF-κB p65在乳腺組織中蛋白表達

2.3TNBC患者乳腺組織中Notch1-NF κB水平與臨床病理特征的關系發生淋巴結轉移的患者，乳腺病變組織中Notch1水平顯著高于無淋巴結轉移者，但和NF-κB水平二者比較差異無統計學意義(P>0.05)。病理學分級和TNM分期不同，Notch1-NF κB水平均有差異，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　40例TNBC患者Notch1和NF-κB水平與臨床病理的關系

3討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，發病率在女性腫瘤中占據首位[5]。TNBC約占所有乳腺癌病理類型的15%[6]，因其復發率、轉移率和病死率高，預后差等特點[7]，成為近年來研究熱點。由于TNBC患者雌、孕激素受體均為陰性，失去了內分泌治療的機會，目前，臨床亦無治療TNBC的特異性藥物。因此，了解其發病機制從而尋找新的治療靶點是TNBC研究亟待解決的問題。近年來，有研究發現Notch1-NF κB參與了TNBC的形成[4，8]，但Notch1-NF κB活性與TNBC患者臨床病理學特點之間的關系還不明確。

Notch信號途徑是一條高度保守的信號通路，廣泛表達于哺乳動物的多種成熟組織中[9]。大量的研究證實，Notch信號對乳腺腫瘤的發生具有重要調控作用，在不同的組織細胞中被激活后，可表現為致瘤性[10]，也可表現為抑瘤性[11]。其中，多數研究認為Notchl在多種惡性腫瘤中有促癌作用[12-13]。本研究應用免疫組織化學和Western blot方法，分別從形態學和蛋白定量分析兩方面觀察到：TNBC患者乳腺組織中的Notchl表達顯著高于良性乳腺腫物患者，這與既往的研究結果一致。為了研究Notch1的表達強弱與患者臨床病理特征之間的關系，本研究應用ELISA測定了乳腺組織中Notch1的水平，發現發生淋巴結轉移的患者，乳腺組織中Notch1的水平顯著高于未發生淋巴結轉移者。隨著腫瘤病理學分級和TNM分期級別的升高，Notch1水平的增加差異有統計學意義。以上結果提示：Notch1不僅參與了TNBC腫瘤的形成，而且其表達與患者病情嚴重程度(淋巴結轉移、病理學分級、TNM分期)具有一致性。

NF-κB，在胚胎發育、淋巴細胞的差異性凋亡、免疫和炎性反應中起重要作用[14-15]。其活性可受Notch1調節。在正常細胞內，NF-κB通常以無活性的前體形式(p50、p65、Rel B，c-Rel)存在于胞質中。Phospho-NF-κB p65，作為p65的活性形式通常代表活化的NF-κB水平。本研究將TNBC患者不同分級、分期和有無淋巴結轉移等各因素之間進行乳腺組織NF-κB水平的相互比較，結果提示NF-κB在TNBC臨床進展中有促進作用。

綜上，Notch1和NF-κB在TNBC患者中明顯高表達，Notch1-NF κB通路的激活與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關。因此，抑制Notch1-NF κB活性可能會成為TNBC治療的一個新靶點，待進一步動物實驗和臨床研究的驗證后，可為乳腺癌的控制或緩解提供一定的理論依據。

參考文獻

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doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.014

*基金項目：柳州市科學技術局(2014J030408)。

作者簡介：覃舒婷(1983-)，主治醫師，碩士，主要從事研究乳腺癌的綜合治療。

[中圖分類號]R655.8

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)15-2075-03

(收稿日期：2015-11-18修回日期：2016-01-15)

The expression and clinical value of Notch1-nuclear regulatory factor κB in human triple-negative breast cancer*

Qin Shuting，Mo Junyang，Zhang Minmin，Tang Qian

(Departmentofthe3rdGeneralSurgery，thePeople′sHospitalofLiuzhouCity，Liuzhou，theGuangxiZhuangAutonomousRegion545005，China)

[Abstract]ObjectiveTo detect the expression and clinical value of Notch1-nuclear regulatory factor κB(Notch1-NF κB) in human triple-negative breast cancer(TNBC).MethodsA total of 66 breast cancer patients and 62 breast benign tumor patients from general surgery department were included in this study.Immunohistochemical stain and Western-blot were employed to detect the expression of Notch1-NF κB in mammary tissue of all patients.ELISA was used to detect Notch1-NF κB content in mammary gland tissue of TNBC those of different pathological features.ResultsImmunohistochemical stain showed that Notch1-NF κB was highly expressed in mammary gland tissues of TNBC and weakly expressed in benign tumor patients.Western-blot results showed the Notch1-NF κB protein level significantly increased in mammary gland tissues of TNBC patients compared with those with benign tumor(P<0.05).The expression of Notch1-NF-kB was significantly associated with TNM stage and histological grade(P<0.05).ConclusionNotch1-NF κB was highly expressed in mammary gland tissue of TNBC patients，and their expressions were closely related with the occurrence，development and metastasis of TNBC.

[Key words]breast neoplasms；immunohistochemistry；transcription factors；triple-negative breast cancer；Notch1；nuclear regulatory factor κB