HOXB9和E2F1在結腸癌中的表達及其意義

陳麗梅，康穎娜，程紅平，李貴春，方　科△

(1.江西省鷹潭市人民醫院腫瘤科　335000；2.湖南省婁底市中心醫院腫瘤科　417000)

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HOXB9和E2F1在結腸癌中的表達及其意義

陳麗梅1，康穎娜2，程紅平1，李貴春1，方科1△

(1.江西省鷹潭市人民醫院腫瘤科335000；2.湖南省婁底市中心醫院腫瘤科417000)

[摘要]目的探討同源盒基因9(HOXB9)和E2F1在結腸癌中的表達及其是否存在相關性。方法采用免疫組織化學染色法和Western blot法檢測江西省鷹潭市人民醫院2012年1月至2015年1月65例結腸癌術后病理標本中結腸癌組織和正常結腸組織中HOXB9和E2F1蛋白的表達，并進行統計學分析。結果HOXB9和E2F1在結腸癌組織中均高表達(P<0.05)，HOXB9在結腸癌中的表達程度與淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期呈正相關(均P<0.05)；而E2F1在結腸癌中的表達程度與浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期呈正相關(均P<0.05)；HOXB9和E2F1在結腸癌組織中的表達呈正相關(P<0.05)。結論HOXB9和E2F1與結腸癌的發生相關，并且在其侵襲轉移過程中發揮重要作用。

[關鍵詞]結直腸腫瘤；基因，同源盒；HOXB9；E2F1；侵襲與轉移

結腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，近些年其發病率呈上升趨勢。盡管隨著新型腹腔鏡手術方式的開展和新型靶向藥物的應用，結腸癌患者5年生存率已經有了很大改善，但病死率仍高。主要死亡原因為腫瘤的復發和遠處轉移。結腸癌轉移相關的基因有血管內皮生長因子(VEGF)、WNT5α和KITENIN，但目前能應用于臨床治療的靶向藥物主要靶點只有Ras基因和VEGF[1]。

HOXB9是HOX家族中的成員，包括39個基因，分為4個基因簇，分別是HOX A、B、C和D，并且分布在4條不同染色體上。HOX基因家族在胚胎發育過程中起著重要作用，近些年的研究表明HOX基因家族在腫瘤中有表達，包括白血病、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌和卵巢癌[2]。研究表明，HOXB9是WNT/T細胞因子4(TCF4)信號通路的靶基因，WNT/TCF4信號通路參與了細胞增殖、分化、胚胎分割和四肢形成等過程[3]。HOXB9還可通過上皮細胞間充質轉化(EMT)途徑促進新生血管形成和遠處轉移從而促進乳腺癌進展[4]。研究表明，HOXB9蛋白在乳腺癌中表達上調并促進腫瘤進展，并且在乳腺癌中的研究顯示E2F1可以與HOXB9基因的轉錄因子結合位點結合，上調HOXB9的表達[5]。在實體標本中免疫組織化學結果也證實HOXB9和E2F1表達存在顯著的相關性(P<0.01)。但在胃癌中表達卻下降，低表達的HOXB9與胃癌的不良預后有關[6]。

但在結腸癌中的觀點有分歧，Zhan等[2]認為HOXB9在分化良好的結腸癌患者組織中高表達，并且與較長的生存時間相關，并且體外實驗顯示HOXB9過表達可以抑制結腸癌細胞生長、侵襲、轉移。但Huang等[1]卻認為HOXB9在結腸癌組織中過表達，并且與轉移和不良預后相關(P<0.05)。在轉移淋巴結中發現HOXB9高表達，下調HOXB9表達后可以抑制癌細胞的遷移和侵襲能力，而增強HOXB9的表達卻能加強癌細胞的侵襲和遷移。筆者為了證實HOXB9在結腸癌中是否高表達，是否與腫瘤的侵襲轉移有關，開展了本研究，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取江西省鷹潭市人民醫院2012年1月至2015年1月經病理確診的結腸癌術后新鮮標本和石蠟包埋的病理標本65例，分別選擇結腸癌陰性切緣(正常結腸組織，距腫瘤組織5～8 cm)和結腸癌組織進行切片。

1.2主要試劑免疫組織化學一抗為美國Molecular Tag公司原裝進口；多聚賴氨酸、SP二抗試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自鎮江厚普生物科技有限公司進口分裝；Western blot一抗為兔抗人HOXB9多克隆抗體、兔抗人E2F1多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體均購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學法采用免疫組織化學染色SP法檢測人結腸癌術后標本中腫瘤組織和陰性切緣中HOXB9和E2F1的表達部位及強度。操作步驟：切片4 μm，60 ℃烤片過夜；常規脫蠟水化，水洗；高溫、高壓修復5 min；滴加一抗4 ℃過夜；滴加二抗；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37 ℃，20 min；DAB顯色；蘇木素復染；顯微鏡觀察；圖像分析。

1.3.2Western blot法取術后新鮮病理標本，在腫瘤組織和陰性結腸切緣進行取材，將組織剪碎，使用細胞裂解液提取蛋白。用蛋白質定量試劑盒(BCA)法進行蛋白水平測定。取75～100 μg蛋白在100 g/L進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，后轉移至硝基纖維素濾膜，50 g/L脫脂奶37 ℃封閉1 h，加入兔抗人一抗，于4 ℃孵育過夜；加入羊抗兔二抗常溫孵育1 h，在凝膠1次成像儀內曝光成像，以β-actin為內參照。

1.3.3結果判定HOXB9和E2F1染色陽性信號為細胞核出現棕黃色顆粒，每張切片選取5個高倍鏡視野(細胞計數200)，觀察陽性細胞染色強度并計數陽性細胞百分率。首先按照染色強度計分：0分為無染色，1分為淺黃色，2分為黃色，3分為棕黃色；再按照陽性細胞百分比計分：陽性細胞小于5%為0分；5%～<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～<75%為3分，大于或等于75%為4分。二者相乘為最后得分[7]。并采用最后得分作為染色程度進行統計學分析。

1.4統計學處理采用SPSS13.0統計軟件進行分析。免疫組織化學結果為等級資料，采用配對Wilcoxon秩和檢驗；病理學參數和免疫組織化學數據為等級資料，他們之間的相關性分析采用兩變量之間的Spearman秩相關分析。檢驗水準α=0.05。以P<0.05為差異有統計學。

2結果

2.1HOXB9和E2F1在結腸癌中高表達HOXB9和E2F1在正常結腸組織和結腸癌中的免疫組織化學染色圖片，見圖1～4。從圖1、2的比較可以看出HOXB9在結腸癌細胞的細胞核中深染，呈棕黃色。在正常結腸組織細胞核中淡染。同一個視野下染色細胞數量較正常結腸組織中多，可以認為HOXB9在結腸癌中高表達；同樣，從圖3、4的比較可以看出E2F1在結腸癌細胞胞核中深染，在正常結腸組織中淡染，并且同一個視野下染色細胞較正常結腸組織明顯多。Western blot 結果也顯示腫瘤組織中HOXB9和E2F1高表達，正常結腸組織中少量表達，與免疫組織化學結果相符(圖5)。以免疫組織化學最后評分代表HOXB9和E2F1的免疫組織化學染色程度，其值的高低表示HOXB9和E2F1的表達程度高低。對正常結腸組織和結腸癌組織中HOXB9和E2F1免疫組織化學染色評分進行配對樣本Wilcoxon秩和檢驗，HOXB9在結腸癌和正常結腸組織中的表達差異有統計學意義(Z=-6.943,P<0.05)，在結腸癌組織中高表達。E2F1在結腸癌組織中也處于高表達，差異有統計學意義(Z=-7.023，P<0.05)，見表1。

圖1　HOXB9在結腸癌組織中的表達(SP,×100)

圖2　HOXB9在正常結腸組織中的表達(SP,×100)

圖3　E2F1在結腸癌組織中的表達(SP,×400)

圖4　E2F1在正常結腸組織中的表達(SP，×100)

圖5　HoxB9和E2F1的Western blot 成像結果

項目n免疫組織化學染色評分1分2分3分4分6分8分9分ZP正常結腸組織HOXB96594367000-6.9430.000結腸癌組織HOXB9650101537012正常結腸組織E2F165124265000-7.0230.000結腸癌組織E2F16500095015

2.2HOXB9的表達程度與結腸癌病理學參數的關系將HOXB9在結腸癌的免疫組織化學染色評分結果與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和病理分期(AJCC2003年版TNM分期)分別進行Spearman秩相關分析，HOXB9在結腸癌中的表達與性別、年齡、分化程度、浸潤深度無相關(P>0.05)，而HOXB9在結腸癌中的表達程度與淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期均呈正相關(r=0.406、0.550、0.475，P<0.05)，見表2。

表2　HOXB9表達與結腸癌病理學參數的Spearman秩相關分析

2.3E2F1的表達程度與結腸癌病理學參數的關系同樣，將E2F1在結腸癌的免疫組織化學染色評分結果與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和病理分期分別進行Spearman秩相關分析，E2F1在結腸癌中的表達與性別、年齡、分化程度均無相關，差異無統計學意義(P>0.05)。而E2F1在結腸癌中的表達程度與浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期呈正相關(r=0.295、0.387、0.542、0.375，P<0.05)，見表3。

表3　E2F1表達與結腸癌病理學參數的Spearman秩相關分析

2.4HOXB9與E2F1在結腸癌中的表達關系將HOXB9與E2F1在結腸癌中的表達程度作Spearman檢驗，HOXB9、E2F1在結腸癌和正常結腸組織中的表達均無相關性(P>0.05)；而HOXB9和E2F1在結腸癌組織中的表達呈正相關(r=0.356，P<0.05)，見表4。

表4　HOXB9與E2F1在結腸癌中表達的Spearman秩相關分析

3討論

結腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，也是美國癌癥相關病死率中位于第2位，每年全球也有將近120萬新發結腸癌患者[8]。Ⅰ、Ⅱ、ⅢA期結腸癌手術治療效果好，轉移性結腸癌治療以化療為主，近幾十年以表皮生長因子受體(EGFR)、VEGF等靶點的分子靶向治療取得了很大進步。但這些靶向藥物通常需聯合化療，單獨應用效果不佳，通常只能作為二、三線方案，或不適合化療的患者。因此更多的治療靶點有待挖掘。

HOXB9在多種腫瘤組織中高表達，并且與腫瘤的侵襲轉移和不良預后相關。研究顯示E2F1可以結合到HOXB9基因啟動子-404至-392核苷酸區域，促進基因轉錄，HOXB9可以活化TGFβ-ATM軸，引起細胞周期檢查點活化和啟動基因修復，從而使細胞從G1期到S期，啟動細胞增殖[5]。本研究結果顯示，HOXB9和E2F1在結腸癌組織中均高表達，在正常結腸組織中低表達，差異有統計學意義(P<0.05)。而且HOXB9和E2F1在結腸癌組織中的表達程度與在相應正常結腸組織中的表達程度無相關性(P>0.05)，也就是說在結腸癌組織中高表達并不受正常結腸組織中表達程度的影響?？梢哉J為HOXB9和E2F1在結腸癌形成過程中發揮作用。

HOXB9在結腸癌中的表達程度與淋巴結轉移程度、遠處轉移、TNM分期均呈正相關(P<0.05)。結腸癌患者淋巴結轉移程度越高，HOXB9蛋白表達越高，有遠處轉移患者HOXB9表達越高，TNM分期越晚，其表達程度越高。而E2F1在結腸癌中的表達程度與浸潤深度、淋巴結轉移程度、遠處轉移、TNM分期均呈正相關(P<0.05)。同樣，結腸癌浸潤越深、淋巴結轉移程度越高，E2F1表達程度越高，有遠處轉移患者E2F1表達程度也越高，以及TNM分期越晚，其表達程度也越高。淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期正是結腸癌侵襲轉移的病理學參數，結合本研究結果，可以看出HOXB9和E2F1可能在結腸癌浸潤轉移中發揮著重要的作用。并且在結腸癌組織中，HOXB9和E2F1的表達也呈正相關(P<0.05)，這與他們之間的相互作用關系有關。正是由于E2F1可以結合到HOXB9啟動子區域，促進其轉錄，如果能阻斷這一相互作用，就能有效抑制結腸癌的轉移過程。

總之，HOXB9和E2F1在結腸癌組織中高表達，可能參與了結腸癌的形成過程，并且與結腸癌的侵襲轉移有關。但是否能針對HOXB9與E2F1研究有效的治療藥物還需要進行阻斷這一相互作用的藥物進行結腸癌動物模型的實驗。

參考文獻

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[2]Zhan J,Wang P,Niu M,et al.High expression of transcriptional factor HOXB9 predicts poor prognosis in patients with lung adenocarcinoma[J].Histopathology,2015,66(7):955-965.

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[4]Chiba N,Comaills V,Shiotani B,et al.Homeobox b9 induces epithelial-to-mesenchymal transition-associated radioresistance by accelerating DNA damage responses[J].ProcNati Acad Sci U S A,2012,109(8):2760-2765.

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[7]方科,莊建良,蘇子劍,等.成纖維細胞生長因子19和成纖維細胞生長因子受體4在食管鱗癌中的表達及其意義[J].重慶醫科大學學報,2013，38(8):876-880.

[8]Recondo G,Diaz-Canton E,de la Vega M,et al.Advances and new perspectives in the treatment of metastatic colon cancer[J].World J Gastrointest Oncol,2014,6(7):211-224.

作者簡介：陳麗梅(1984-)，主治醫師，本科，主要從事消化系統腫瘤研究。 △通訊作者，E-mail:fangkeqq88@163.com。

doi:·經驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.023

[中圖分類號]R735.1

[文獻標識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)15-2104-03

(收稿日期：2015-11-28修回日期：2016-02-06)