纖維素酶基因克隆與表達研究進展

徐俏冉 楊欣欣 張珊 王瑤 陳建軍

【摘 要】纖維素是廣泛存在于自然界的多糖類物質，纖維素酶能有效地將纖維素分解成單糖加以利用，其在能源、紡織、飼料、食品和造紙等行業具有重要的應用。

由于纖維素酶熱穩定性較低、酶活力不高而不能滿足生產需要，纖維素酶基因的克隆及表達日益被人們重視起來。結合纖維素酶在生產中的應用及市場化的需求，本文概括了近年來國內外對纖維素酶基因克隆與表達的研究進展。

【關鍵詞】纖維素 纖維素酶 基因克隆 工程菌 表達載體

引言

纖維素在人們賴以生存的地球上無處不在，是人們可以利用的可再生資源，但纖維素本身是不可以直接被人們利用的，要先把它降解為可被人利用的物質。目前，在降解纖維素的多種方法中，生物法還是較為有效的[1]，它是利用微生物代謝的產物纖維素酶來降解和轉化纖維素，但是在實際應用方面存在產酶活性較低、轉化率不高、設備耗材超出預算等問題，因此構建出產酶量多，產酶活性高的纖維素酶基因工程菌對纖維素資源的有效利用和社會生產具有重要意義。近年來，隨著分子生物學和基因工程技術的發展，對纖維素酶基因的克隆及表達研究發展迅速，纖維素酶的應用已滲透到人們生產、生活的各個領域。

1 .纖維素

纖維素是一種多糖，它的化學簡寫分子式為（C6H10O5） n，它的熱穩定性很好，在室溫條件下，不易降解，不易分解，一般條件下，并不發生顯著的變化[2]。以150℃為界限，溫度高到一定程度時，也會發生化學反應。纖維素與無機酸，苛性堿溶液以及強氧化劑均可以發生化學反應[3]。

2 . 纖維素酶

2.1 纖維素酶的組成

纖維素酶由三部分組成，分別是：外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，它是靠這三種酶共同作用，來發揮自己的功效的[4]。纖維素酶的最適pH一般在4.5-6.5，過酸或者過堿都可以使酶失活。纖維素酶活力還算比較穩定，但是，目前人們發現了一些抑制劑，可以抑制酶的活力，比如銅離子和汞離子，而相對應的，還有些物質可以解除這種抑制，它就是半胱氨酸[5]，我們可以有效的利用它，來最大程度的發揮酶的活力。

2.2纖維素酶的來源

纖維素酶無處不在，真菌，細菌，放線菌中都有產纖維素酶的菌[6]。目前，報道過的產纖維素酶的菌株主要集中在真菌方面，如黑曲霉Aspergillus Niger、綠色木霉Green trichoderma viride、里氏木霉Magnitude of trichoderma viride、康氏木霉Kang Shimu mildew和嗜熱毛殼菌 QM9381Bacteria QM9381， thermophilic MAO shells 等[7]；細菌中被發現的并不多，如芽孢桿菌Bacillus、瘤胃細菌Rumen bacteria（黃化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等）和熱纖梭菌Thermal fiber clostridium等。

2.3 纖維素酶的作用機理

纖維素酶降解纖維素的過程中，首先纖維素酶要結合到底物上，形成酶-纖維素二元復合物，完成纖維素酶降解纖維素的第一步，即吸附[8]。由于吸附的條件不同，吸附的效果也不同。內切葡聚糖酶先發揮作用后，外切葡聚糖酶再發揮作用，β-葡萄糖苷酶與其二者協同作用，共同將纖維素分解為葡萄糖。內切葡聚糖酶先作用于微纖維的非結晶區，將其分解成大小不等的短鏈，外切葡聚糖酶作用于這些短鏈，生成纖維二糖，最后β-葡萄糖苷酶作用于纖維二糖等，生成葡萄糖。

2.4 纖維素酶的應用

纖維素酶在食品發酵工業、動物飼料行業、紡織和造紙行業中都有廣泛的應用，在石油勘探、中藥成分的提取等領域中也有所涉及。在酒精生產中，添加纖維素酶不僅可以提高啤酒的純度和啤酒生產的速度，而且可以保證啤酒的質量及提高啤酒的口感[9]。在飼料中，添加纖維素酶不僅可以促進消化，還有利于提高家畜的體重[10]。在紡織行業中，采用纖維素酶對織物進行洗滌時，其可以對纖維表層進行有效的控制，從而使織物均勻褪色[11]。

3 .纖維素酶基因克隆及表達的研究

隨著分子生物學、遺傳工程的迅猛發展，國內外均在嘗試應用基因工程技術來改造和構建高效纖維素降解菌，而且對特殊環境中的纖維素酶產生菌也產生了濃厚的興趣。這些菌具有獨特的酶學性質，擴大了纖維素酶的應用范圍[12]。

在20 世紀70 年代，纖維素酶基因的克隆開始興起并蓬勃發展起來。到目前為止，人們克隆到纖維素酶的基因并不是單一的，在成千上萬個物種中都有發現與收獲，其中在細菌和真菌中尤其廣泛[13]。同時，克隆到的酶基因能否成功的表達也十分重要，已有文獻證明纖維素酶在大腸桿菌中表達是比較普遍而且高效的[14]，另外，人們還在逐步尋找其他的表達載體。但是與國外相比，國內對纖維素酶的研究還很緩慢，很多菌株因為產酶能力低或者熱穩定性差而不能被很好的應用。

如今，很多學者已克隆出不少的纖維素酶基因，而且其中一大部分都在大腸桿菌中進行了表達[15]。

寧玉潔等[16]從約氏梭菌屬CJ-1菌株中克隆出基因片段Cel9C，大小為1943 bp，編碼647個氨基酸，將該基因構建于大腸桿菌表達載體pET28a（+）中，獲得重組表達載體pET28a-Cel9C，轉化至大腸桿菌菌株BL21（DE3）中進行表達。

Kim等[17]將耐熱菌Aqu ifex aeolicus VF5中編碼耐熱內切葡聚糖酶的基因（Cel8Y）克隆并且轉導入大腸桿菌XL1-Blue中，通過表達和檢測，發現內切葡聚糖酶在80℃時酶活最大。

李春華等[18]以CpoI and NotI限制性內切酶雙酶切衍生于質粒pGEX的大腸桿菌表達載體pHBM625，然后將經T4 DNA polymerase處理后的β-1， 4-內切葡聚糖酶基因克隆至載體pHBM625中得到重組質粒pHBM625中，最后通過平板檢測及SDS-PAGE凝膠電泳，均檢測到該基因在大腸桿菌XL10-Glod中的表達。

雖然纖維素酶克隆與表達的研究在現階段已經取得了很大的進展，但表達、分泌均較弱，并沒有在真正意義上得到高效分解纖維素的工程菌，不能大規模的應用于生產[19]。由此觀之，雖然纖維素酶具有廣闊的應用前景和良好的發展前途，但人們對纖維素的世界了解的還不夠深入透徹，有很多未知的領域等待我們探索和突破，另外，纖維素酶還有良好的商業價值，人們在生產的各個領域，如果能使纖維素酶發揮出應有的功效，那將是酶工程的一項重大突破[20]。

4 . 展望

迄今為止，很多纖維素的潛在資源沒有被人們利用，既造成了環境污染，也浪費了資源，并對物質資源造成了很大的壓力[21]。有研究報道顯示，我國是農業大國，很多玉米等谷物的麥稈都被焚燒，世界的麥稈每年產量約40億噸，光被我國燃燒掉的就占了八分之一，如果我們可以把這些資源利用起來，變廢為寶，不僅可以緩解環境的壓力，也可以很好的解決資源浪費的問題。很多發達國家的纖維素的利用率比我國高出了五分之一，所以，我們應該學習他們的先進技術，努力構建高產纖維素酶的基因工程菌，并把它用于生產實踐，解決我國纖維素資源浪費的問題。相信在不久的將來，纖維素酶會在我們生活的各個領域發展壯大，將會給人們帶來巨大的經濟效益，會給商品化社會帶來推動作用，會更加便于人類的生活。

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通訊作者：陳建軍