有氧運動聯合褪黑素對二型糖尿病大鼠骨質疏松影響的實驗研究

景會鋒 王小梅

延安大學體育學院，陜西 延安 716000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是常見的代謝性骨病，近年來我國OP的患病率呈現出逐年增加的趨勢，以往研究表明，糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者半數以上合并OP[1]，其發病機制尚不明確。運動和褪黑素對于2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)的益處十分明顯，能有效改善糖尿病人的血脂代謝紊亂，降低氧化應激損傷，有效緩解癥狀[2]；運動訓練作為調控骨代謝的重要因素之一，其對骨產生的力學刺激可顯著提高骨中細胞因子轉錄、蛋白表達和骨量等，從而防治骨質疏松[3]。最近研究表明，褪黑素除了參與機體生物節律、生殖、體溫、免疫功能、心血管發育等方面的調節以外，還可以通過提高抗氧化、影響降鈣素和甲狀旁腺素的分泌，參與了鈣的新陳代謝，對骨的形成、骨量的增加等方面有積極作用[4]。隨著人年齡增長(尤其是女性)，血清中的褪黑素水平下降，骨質疏松癥的發生幾率明顯增加[5]，且與此相關。對2型糖尿病與骨質疏松的相關性，國內外學者有所探討[6,7]，但鮮有從運動療法方面結合褪黑素對糖尿病骨質疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP) 的關系做進一步的研究。本實驗用DM大鼠模型，綜合評價有氧運動結合外源性褪黑素的補充對T2DM患者預防OP的作用，對改善糖尿病患者的癥狀，預防并發癥的發生有實際意義。

1 材料和方法

1.1 材料

雌性SD大鼠80只(購于西安交通大學實驗動物管理中心)，6w，體重200～220g，動物室內溫度(22±2)℃，相對濕度45%～55%，每天按自然晝夜照明，光照時間12h，分籠飼養，自由飲水，國家標準嚙齒類普通飼料喂養。

1.2 實驗方法

1.2.1大鼠分組及DOP模型的建立：適應性喂養1 w后，隨機分為8組：安靜對照組(N)、正常有氧運動組(E)、正常褪黑素組(M)、正常有氧運動褪黑素組(EM)、糖尿病對照組(D)、糖尿病有氧運動組(DE)、糖尿病褪黑素組(DM)、糖尿病有氧運動褪黑素組(DEM)，每組各10只，N組大鼠不加任何干預，D、DE、DM和DEM組大鼠一次性腹腔注射35 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)，STZ購買于Sigma公司，現配現用，注射7 d后尾靜脈采血測試血糖濃度，血糖濃度大于16.7 mmol/L且持續3 w，為暫時成模大鼠[8]。注射STZ后，D組大鼠在實驗結束前第13天進行頸部皮下注射鹽酸四環素(25 mg/kg)，作為第1次熒光標記，在實驗結束前第3天進行頸部皮下注射calcein(5 mg/kg)作為第2次熒光標記，以在骨表面形成黃色和綠色雙熒光標志，兩次熒光標記間隔時間為10 d，可動態觀察兩次注射期間骨形成的情況。末次實驗后分離大鼠右側脛骨，用甲基丙烯酸甲酯包埋做不脫鈣骨切片，采用半自動圖像數字化分析儀并計算出新生骨小梁面積百分比，D組大鼠脛骨上段骨小梁面積百分數由25.71降低到14.78，提示D組大鼠伴隨骨量丟失。

1.2.2褪黑素干預：褪黑素購買于Sigma公司，使用前溶于2%的乙醇溶液中，M組、EM組、DM組和DEM組大鼠每天灌胃40 mg/kg褪黑素，N組、E組、D 組和DE組每天灌胃等體積的2%乙醇溶液。

1.2.3運動訓練方案：E、EM、DE和DEM組大鼠采用遞增負荷的方式進行跑臺有氧運動，起始速度為10 m/min，時間為20 min，適應性訓練1 w后開始正式訓練。運動負荷參考Bedford的研究加以調整，每周訓練5 d，速度逐漸遞增由10 m/min增至20 m/min，訓練時間遞增值為5 min/d[9]。整個訓練過程共持續6 w，EM組和DEM組大鼠灌胃給藥30 min后開始訓練。

1.2.4儀器設備與觀察指標的測定：于末次訓練結束后，按50 mg/kg的劑量腹腔注射2%的戊巴比妥鈉溶液麻醉后，仰臥位置于DXA探頭之下，固定四肢，使椎體保持豎直，雙側股骨保持水平狀態，應用雙能X線BMD測定儀測定腰椎(L3-L6)和左右股骨BMD。BMD測試結束后，迅速分離頸總動脈，采血4 mL，注入含乙二胺四乙酸鈉30 μL和10%抑肽酶40 μL的試管中，混勻，離心半徑12 cm，離心(3000 r/min，10 min，4℃)，分離血漿，-20℃保存，備用待測血糖、SOD(superoxide dismutase)、MDA(malonaldehyde)、GSH-Px(glutathione peroxidase)、血Ca、P、PTH(parathyroid hormone)，血糖和血Ca、P測定應用東芝全自動生化分析儀，SOD、MDA、GSH-Px 的測試嚴格按照試劑盒說明，試劑盒購于南京建成生物科技有限公司，應用放射免疫法測定PTH，PTH放免試劑盒購自中國人民解放軍總醫院長城免疫研究所。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠體重的變化

表1 各組大鼠體重的變化Table 1 The change of body weight in rats of each group (g, n=10,

注： 和N組比較，▲P<0.05；與D組比較，★P<0.05；與DE和DM組比較，●P<0.05

Notice：Statistically significant differences when compared to N(▲P<0.05);Statistically significant differences when compared to D(★P<0.05);Statistically significant differences when compared to DME and DMM(●P<0.05)

由表1可知，與N組比較，E、M、EM組大鼠體重下降，但是無顯著性差異(P>0.05)，D組大鼠體重顯著性下降(P<0.05)；與D組比較，有氧運動和褪黑素干預后大鼠體重顯著性升高(P<0.05)，與DME和DMM組比較，運動和褪黑素聯合干預后大鼠體重進一步升高(P<0.05)。

2.2 各組大鼠椎骨和左右股骨BMD的變化

由表2可知，與N組比較，E、M、EM組大鼠椎骨和左右股骨BMD顯著性升高(P<0.05)，D組大鼠椎骨和左右股骨BMD顯著性下降(P<0.05)；與D組比較，有氧運動干預后大鼠椎骨和左右股骨BMD顯著性升高(P<0.05)，褪黑素干預后大鼠椎骨和左右股骨BMD升高，但不具有顯著性差異(P>0.05)，與DME和DMM組比較，運動和褪黑素聯合干預后大鼠椎骨和左右股骨BMD顯著性升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠椎骨和左右股骨BMD的變化Table 2 The change of vertebral and femoral BMD in rats of each group (g/cm2,

注： 和N組比較，▲P<0.05；與D組比較，★P<0.05；與DE和DM組比較，●P<0.05

Notice：Statistically significant differences when compared to N(▲P<0.05);Statistically significant differences when compared to D(★P<0.05);Statistically significant differences when compared to DME and DMM(●P<0.05)

2.3 各組大鼠血糖與血清總Ca、P和PTH的變化

表3 各組大鼠血糖與血清總Ca、P和PTH的變化Table 3 Changes of blood glucose, serum total Ca, P, and PTH in rats of each group

注： 和N組比較，▲P<0.05；與D組比較，★P<0.05；與DE和DM組比較，●P<0.05

Notice：Statistically significant differences when compared to N(▲P<0.05);Statistically significant differences when compared to D(★P<0.05);Statistically significant differences when compared to DME and DMM(●P<0.05)

由表3可知，與N組比較，E、M、EM組大鼠血糖、血PTH、血Ca和血P無顯著性變化(P>0.05)，D組大鼠血糖和血PTH顯著性升高(P<0.05)，血Ca顯著降低(P<0.05)，血P無明顯變化(P>0.05)；與D組比較，有氧運動和褪黑素干預后大鼠血糖和血PTH顯著性降低(P<0.05)，血Ca顯著升高(P<0.05)，血P無明顯變化(P>0.05)，與DE和DM組比較，運動和褪黑素聯合干預后大鼠血糖和血PTH顯著性降低(P<0.05)，血Ca顯著升高(P<0.05)，血P無明顯變化(P>0.05)。

2.4 各組大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性和MDA含量的變化

表4 各組大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性和MDA含量的變化Table 4 The changes of SOD, GSH-Px activity, and MDA content in rats of each

注： 和N組比較，▲P<0.05；與D組比較，★P<0.05；與DE和DM組比較，●P<0.05

Notice：Statistically significant differences when compared to N(▲P<0.05);Statistically significant differences when compared to D(★P<0.05);Statistically significant differences when compared to DME and DMM(●P<0.05)

由表4可知，與N組比較，E、M、EM組大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，D組大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；與D組比較，有氧運動和褪黑素干預后大鼠血清中的SOD、GSH-Px 活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，與DE和DM組比較，運動和褪黑素聯合干預后SOD、GSH-Px 活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。

3 討論

以往對D2M的研究表明，病程持續時間越長，體重降低程度則越明顯，Tong等[10]研究發現模擬失重可明顯降低大鼠的股骨生物力學指標值，由此表明，體重下降是發生骨質疏松的危險因素之一；另有部分研究則顯示BMD與體脂百分比呈正相關，單就BMD與脂肪的關系而言，目前研究尚未取得一致結果，徐君翔[11]認為脂肪含量對BMD有顯著的影響，局部脂肪比例增加BMD下降顯著。本研究則證實，隨著D2M大鼠體重下降，體脂降低，BMD下降，有氧運動和褪黑素干預后可明顯抑制大鼠體重下降，同時BMD下降的趨勢也得到緩解。

運動是影響BMD的一個重要因素。運動方式不同對骨骼的負荷作用不同，對BMD產生的不同影響。適度的運動在增加肌肉重量、增強肌力的同時，BMD也可獲得不同程度的提高，有研究顯示，肌力與BMD呈正相關，肌力的增加有助于骨量的維持[12,13]。大量研究證明，體育鍛煉可增加峰值的骨量，而峰值骨量是決定是否出現骨質疏松癥狀的關鍵性因素。研究發現中等強度跑臺運動通過抑制骨吸收對去卵巢大鼠股骨下端松質骨的骨量和骨結構產生了良好的影響[14]。另有研究表明高強度運動，更有利于骨的礦化[15]；同時隨著運動強度的增加，BMD值逐步增加。本研究也證實運動能改善BMD，運動時骨骼受到擠壓力和剪切力的直接刺激作用外，還有來自肌肉收縮對骨骼的牽拉刺激，有助于骨形成和重建，從而增加BMD；另外，運動還能增加胃腸道對營養物質和鈣的吸收，體內維生素D濃度增高等作用來提高BMD。綜上所述，運動對大鼠骨產生的直接力學刺激有可能通過提高骨形成并抑制骨吸收，從而使得大鼠BMD顯著增加。

血清Ca、P測定是可間接反應骨代謝情況[16]。已有研究表明，糖尿病大鼠長期的高血糖會引起Ca、P攝入減少而丟失增加，血Ca降低，PTH分泌增加，動員大量骨Ca入血，致使骨質疏松[17]，也有臨床證據表明長期高血糖環境不利于骨膠原交聯[18]。另外，Balint等指出高血糖毒性作用可以成骨細胞抑制對Ca的攝取，可能與糖尿病發生時骨結構改變有關。在 T1DM患者中BMD值是降低的，對T2DM患者的大量研究表明，BMD值可以正常，降低或升高。本研究則證實，D2M大鼠血糖和PTH水平顯著升高的同時，伴隨血Ca顯著降低，椎骨和左右股骨BMD均顯著性下降，這或許是由于D2M大鼠長期的高血糖能夠降低血Ca水平，而低血Ca進而影響骨礦化，使得血PTH反饋升高，并且與血糖升高水平成正相關，從而降低BMD。因此，可以認為糖尿病通過高血糖引起的低血Ca、高PTH降低BMD，形成骨質疏松。

褪黑素主要由松果體合成與分泌，近年來眾多實驗證明，褪黑素對于骨的重建過程具有重要作用，一方面能促進骨的發生，另一方面能防止骨的退化。外源性褪黑素促進了多種前成骨細胞系以及人骨髓間充質干細胞的進一步分化，在骨的發生中有至關重要的調節作用，能促進成骨過程。褪黑素在鈣新陳代謝方面的作用最初由Csaba等研究發現，這個作用由褪黑素通過影響降鈣素與PTH的分泌介導的。本研究也證實褪黑素干預后，血糖和血清PTH降低，血鈣升高，同時伴隨BMD的增加。

大量研究表明，當DM患者血糖水平升高時，會使氧化應激水平增高，從而促進DOP的發生與發展，這點提示控制血糖可能是防治DOP的一個非常重要途徑[19]。氧化應激主要通過耗竭抗氧化物質、激活破骨細胞、抑制成骨細胞及骨形成來影響骨代謝。血清中的SOD、GSH-Px活性和MDA含量一直被認為是反映氧化應激的敏感指標[20]，本研究表明，T2DM大鼠血清中的SOD、GSH-Px活性降低和MDA含量升高，抗氧化應激能力減弱，骨代謝過程紊亂。以往研究表明，運動特別是有氧運動可以提高機體的抗氧化應激的能力[21]，褪黑素是一種非酶類抗氧化物質，具有較強的抗氧化應激作用[22]，本研究結果顯示，經過6w的有氧運動和褪黑素治療后，血清中SOD和GSH-Px活性明顯升高，MDA含量明顯下降，從而減少氧化應激損傷。規律運動能夠穩定控制血糖水平已被諸多研究所證實。但是不同方式運動對血糖影響的報道不多，且尚有爭議。大量資料表明, 對于改善糖和胰島素抵抗代謝, 有氧運動能夠加快骨骼肌對糖的攝取，從而有效降低血糖。本研究表明，有氧運動和褪黑素干預后大鼠血糖顯著性降低，血Ca顯著性升高，同時血PTH水平降低，且聯合干預后大鼠后效果更好。近年研究[23]證實，高糖抑制成骨細胞的增殖、分化，導致成骨細胞功能下降，Orifuji等發現3w的有氧運動可降低Ⅱ型糖尿病大鼠血糖的水平，與本研究的結果相一致。

綜上所述，糖尿病持續高血糖使血Ca下降，PTH反饋性升高和清除自由基能力減弱，引起BMD下降，導致骨質疏松的發生；有氧運動聯合褪黑素共同干預可以明顯改善糖代謝的同時還可以提高抗氧化應激能力，降低高糖氧化應激對骨骼代謝的影響，有效控制體重和BMD下降，緩解骨質疏松，可以為臨床上糖尿病引發的骨質疏松癥的非藥物治療新方法提供實驗依據。