不同時間點的氧糖剝奪對器官型海馬腦片的影響

楊　瀾，南麗紅，何一博，郭　斌，李　煌，黃　枚（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

不同時間點的氧糖剝奪對器官型海馬腦片的影響

楊瀾，南麗紅，何一博，郭斌，李煌，黃枚
（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

目的觀察不同時長的氧糖剝奪對SD乳鼠器官型海馬腦片的影響，探討制備氧糖剝奪（OGD）模型的最佳時長。方法對海馬腦片進行碘化丙啶染色，用微量酶標法檢測培養液上清中LDH的釋放量。結果培養13 d后的腦片逐漸變薄，海馬結構逐漸清晰，生長情況逐漸穩定，無特異性熒光信號，LDH釋放各組無明顯差異性；與造模前24 h相比，隨著缺氧缺糖時間的增加，海馬腦片碘化丙啶染色的熒光信號強度與LDH釋放量增加，以45、60 m in時長最為明顯（P＜0.05或P＜0.01），但氧糖剝奪60 m in腦片的損傷更為嚴重，表現出無法恢復的趨勢。結論制備SD乳鼠海馬腦片氧糖剝奪模型的最佳時長為45min。

海馬腦片；氧糖剝奪；碘化丙啶；乳酸脫氫酶；OGD時間點

腦卒中是一種急性腦血管疾病，因其發病突然、治療時間窗狹窄的特點，導致病后致殘率高［1］。器官型腦片培養是一種新興的腦組織體外培養技術，兼備在體實驗的部分特點和離體實驗的優點，正成為腦卒中后康復研究的常用模型［2］。海馬對缺血缺氧較為敏感［3］，因此，器官型海馬腦片被廣泛應用于缺血缺氧損傷相關機制的研究。我們擬在建立器官型海馬腦片制備和培養方法的基礎上，探討不同時長的氧糖剝奪（Oxygen-Glucose Deprivation，OGD）對器官型海馬腦片的影響，為進一步研究藥物對腦卒中后的康復治療作用提供實驗依據［4-6］。

1　實驗材料

1.1動物清潔級P7-9 SD乳鼠由福建中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（閩）2012-0001。

1.2試劑MEM培養基 （美國Hyclone公司）；Hank's平衡鹽溶液（美國Hyclone公司）；細胞培養用青鏈霉素（美國Hyclone公司，批號：J130071）；馬血清 （美國Gibco公司，批號：1296647）；D-（+）-Glucose（美國 Sigma公司，批號：071M01452V）；Hepes（美國Sigma公司，批號：SLBK4575V）；碘化丙啶（美國Sigma公司，批號：MKBP1360V）；乳酸脫氫酶試劑盒 （南京建成生物工程研究所，批號：20140929）。

1.3實驗儀器Millicell-CM插入式細胞培養皿（美國Millipore公司）；5 000mz型振動切片機（英國Campden Instruments公司）；Forma 371型CO2培養箱（美國Thermo Scientific公司）；Galaxy CO170R型三氣培養箱 （美國NBS公司）；DM IL LED型倒置相差顯微鏡 （德國Leica公司）；EVOSFL型倒置熒光顯微鏡 （美國AMG公司）；SZ760型體視顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）。

2　實驗方法

2.1腦片制備及培養制備方法參考Stoppini方法［7］加以改進。P7-9乳鼠以75%乙醇浸泡消毒后，斷頭取腦，置于預冷的解剖液中，切除小腦、腦干部分，將大腦部分沿矢狀面對半切開，將裸露的腦半球冠狀平面粘附固定于振動切片機載物臺上。用振動切片機沿冠狀平面切下400μm的腦片若干，轉移至盛有預冷解剖液的培養皿中，在體式顯微鏡下分離出海馬組織，轉移至Millicell-CM微孔膜上，每個微孔膜插件放置6個海馬腦片，將插件置于6孔培養板中，從孔邊緣加入1mL培養液。培養液成分：25%HBSS＋50%MEM＋25%Horse＋6.5 g/L DGlucose＋25 mM HEPES，pH 7.2～7.4，培養液含雙抗100 U/mL。將6孔培養板置于95%O2、5%CO2、37℃的CO2培養箱中培養，2 d后更換培養液，之后每3天更換1次培養液。

2.2腦片生長形態觀察腦片培養期間，使用倒置相差顯微鏡對腦片生長形態進行動態觀察，并于培養至第1、5、9、13天時拍照。

2.3分組及OGD損傷模型的建立培養14 d的海馬腦片，分為空白對照組、OGD 15 min組、OGD 30 min組、OGD 45 min組、OGD 60 min組，每組3孔，每孔3片腦片。OGD各組腦片用PBS漂洗3遍，每孔加入1 m L PBS，移入94%N2、5%CO2、1%O2、37℃的三氣培養箱孵育15、30、45、60 min后，吸棄無糖培養液PBS，更換為正常培養液1 mL，重新移入95%O2、5%CO237℃的CO2培養箱中培養。空白對照組不作任何處理。

2.4PI染色于造模前24 h、造模后1、3、5 d進行PI染色。具體方法：每孔加入含50μg/mL PI染液的培養液1 mL，于95%O2、5%CO2、37℃的CO2培養箱中孵育1 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察染色情況。

2.5LDH檢測于造模前24 h、造模后1、3、5 d吸取海馬腦片培養液，離心取上清，根據試劑盒說明書，用微量酶標法測定腦片培養液上清中的LDH含量。

3　結果

3.1腦片生長形態培養1 d的腦片厚度迅速增加，隨著培養時間的增加，腦片逐漸變薄，由邊緣向中心逐漸變得透亮，組織邊緣界線逐漸模糊，觀察到有細胞向周圍浸潤生長，海馬結構逐漸變得清晰可見，培養至13 d腦片生長情況逐漸穩定，見圖1。

3.2PI染色情況PI染色結果顯示，空白對照組海馬腦片各時間點均無特異性熒光信號；OGD 15 min組缺氧缺糖1 d后僅可見極微弱熒光信號，3 d后熒光信號消失；OGD 30 min組缺氧缺糖1 d后出現弱熒光信號，3 d熒光信號有所增強，之后熒光信號逐漸減弱，提示腦組織可能在輕微損傷后啟動自我修復機制完成自我修復；OGD 45 min組缺氧缺糖1 d后出現強熒光信號，3 d熒光信號明顯增強，之后熒光強度維持在相對穩定水平；OGD 60 min組缺氧缺糖后出現極強熒光信號，海馬區域全部紅染，3 d后熒光信號強度未見明顯減弱。

3.3培養液LDH含量檢測各組海馬腦片缺氧缺糖前培養液LDH釋放量無明顯差異（P＞0.05），缺氧缺糖后1 d，OGD 15 min、30 min組的LDH釋放量雖較空白對照組有所增高，但無統計學意義（P＞0.05）；OGD 45 min組、60 min組的LDH釋放量明顯高于空白對照組（P＜0.05或P＜0.01）。在缺氧缺糖后3、5 d各組的LDH釋放量較1 d有所減少，與空白對照組相比，OGD 15 min、30 min組的LDH釋放量無顯著性差異 （P＞0.05）；OGD 45 min組、60 min組的LDH釋放量明顯高于空白對照組（P＜0.05或P＜0.01），見表1、圖2。

表1　不同OGD時長對LDH釋放量的影響

4　討論

4.1對腦片施加OGD處理，可以模擬腦卒中后腦組織周圍缺氧缺糖的微環境。海馬是與哺乳動物學習和記憶相關的關鍵結構，對缺血損傷較為敏感，因此海馬腦片尤其適用于缺血性腦損傷的研究［8］。

4.2本實驗通過對腦片生長狀態的動態觀察，發現培養1 d腦片厚度迅速增加，出現水腫現象，小膠質細胞大量生成，倒置相差顯微鏡下透光性變差。隨著培養時間的增長，腦片逐漸變薄，透光性漸佳，由邊緣向中心逐漸變得透亮，組織邊緣界線逐漸模糊，小膠質細胞數量逐漸減少，海馬結構逐漸變得清晰可見，可見清晰的CA1、CA3區域及齒狀回結構。培養13 d腦片生長情況逐漸穩定，可用于后續OGD實驗。國內外報道的OGD誘導的海馬腦片缺氧缺糖損傷模型主要有浸沒法、充N2法及三氣培養箱缺氧法等，造模時長的選擇更是不盡相同。本課題組在腦片培養技術成熟的基礎上對造模時長進行相關探索，實驗采用PI染色熒光和LDH累積釋放量作為觀察和檢測指標，以評價不同造模時長對OGD誘導的海馬腦片缺氧缺糖損傷模型的影響。PI是一種細胞核染色試劑，其無法穿過完整的細胞膜，但可穿過凋亡或壞死細胞的破損細胞膜與DNA雙鏈結合產生紅色熒光［9］。LDH廣泛存在于機體的細胞中，其滲出是細胞受損的標志，檢測LDH的累積釋放量可反應腦片的存活狀態［10］。研究表明，腦片的PI熒光信號強度和LDH釋放量具有相關性［11］。

本實驗PI熒光染色結果顯示，造模前各組均無紅色熒光信號，造模后1 d除OGD 15 min組外，其它組均出現強度不一的熒光信號，且隨著造模時間的增長，熒光強度逐漸增強，說明缺氧缺糖已造成腦片的損傷。造模后3 d，除OGD 15 min組外，其它組熒光信號均有所增強，推測此現象為遲發性的細胞凋亡或壞死，可能由于海馬腦片無法準確地復制在體腦缺血的神經死亡的時間模式，因此于缺氧缺糖后2～4 d在CA1區出現了損傷的加劇。造模后 5 d，OGD 30 min組的熒光信號趨于消失，OGD 45 min組熒光信號稍有減弱，但仍較為穩定，而OGD 60 min組紅色熒光發散，背景紅染，提示損傷進一步加劇。LDH釋放量檢測結果顯示，造模前各組LDH累積釋放量無顯著差異，造模后1 d各OGD組LDH釋放量均有不同程度的增加，且與造模時間的延長呈正相關，其中OGD 45 min組、OGD 60 min組LDH釋放量明顯高于空白組。此后各組仍維持相應趨勢，且能持續一定時間。

4.3實驗結果表明，在本實驗條件下，缺氧缺糖15、30 min不是制備OGD海馬腦片模型的最佳時長，最佳時長應為45 min以上。在本實驗中我們還觀察到缺氧缺糖60 min的海馬腦片損傷程度較缺氧缺糖45 min的損傷更為嚴重，表現出無法恢復的趨勢。所以，我們認為器官型海馬腦片的OGD誘導時長以45 min為宜，此模型可用于后續的腦卒中康復治療藥物的篩選及作用機制研究。

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R285.5

A

1000-338X（2016）01-0033-03

2015-10-21

福建省衛生和計劃生育委員會資助課題（WZZY201302），福建中醫藥大學校管課題（X2014143、X2014127），國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201510393019）

楊瀾（1990—），男，2013級藥理學專業碩士研究生，主要從事中藥神經藥理研究。

黃枚（1966—），女，教授。E-mail：hmei0303@qq.com